WB常见问题及处理方法.pdf

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1、质检部南京巴傲得生物科技有限公司第1页共6页WB常见问题及处理方法问题描述可能原因验证或解决办法一抗和二抗不匹1.二抗需和一抗宿主的物种相同（如一抗来自配兔，二抗为抗兔抗体）。1.降低一抗的稀释度（二抗一般确认体系之后不调）；2.使用效价高的一抗；没有足够的一抗3.延长抗体孵育时间，一抗4℃过夜，二抗室或二抗结合目标温1-2h；蛋白4.在孵育一抗或者二抗的时候，几张膜叠在一起，导致孵育不充分；5.一抗和二抗量不足，或者膜飘浮在表面，导致孵育不充分。1.选择合适的封闭液（例如磷酸化抗体选择封闭液与一抗或BSA溶液进行封闭）；二抗有交叉反应2.选择合适的一抗，二抗的稀释液（建议

2、选择成分比较清楚的BSA或者明胶）。1.参考说明书，此抗体是否适合这个物种；一抗不识别检测2.分析比对免疫原序列和蛋白序列，保守性强物种的蛋白的可以尝试；无信号3.设置能检测的阳性对照。1.检测样本中目的蛋白表达较少；2.每泳道蛋白上样量少，总蛋白量不低于抗原量不足20-30μg，使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照；3.磷酸化抗体检测优先使用BSA进行封闭。4.使用相应的刺激，使目的蛋白表达丰度提高。组织中目的蛋白1.选择特异表达目的蛋白的组织；含量低2.组织新鲜，及时提取，尽快使用；3.使用相应的蛋白酶抑制剂。质检部南京巴傲得生物科技有限公司第2页共6页1.根据目的蛋白的分子

3、量，选择合适的转膜条件；2.转膜结束后，用丽春红对膜进行染色，分析转膜不充分或电转膜效果（也可对残留胶进行考染，观测转膜极插反没转成功效率）；3.转膜时电极插反，导致转膜失败4.选择相应的转膜液，5.膜孔太大，转膜条件过大，目的蛋白转过。洗膜过度1.降低洗膜强度（洗膜时间，次数和温度）。1.减少封闭时间，考虑封闭温度；过度封闭使目标2.更换封闭剂，使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂蛋白不能显色奶粉的抗体稀释液，代替5%脱脂奶粉、显色液失活1.检测使用的显色液是不是有效，特别是ECL显色中，ECL-B特别容易失效。激发光波长选择不合适1.对于不同荧光标记的二抗，选择合适的激发光波

4、长。1.ECL显色比DAB显色灵敏度高5-10倍；2.ECL发光液分普通，灵敏，超敏，在信号上显色方式的选择有明显的差异；3.延长曝光和显色时间。1.延长封闭条件（一般室温1h）；未进行非特异性2.考虑更换合适的封闭剂（例如使用5%脱脂奶封闭或封闭不充粉）；分3.封闭的时候几张膜在一起，导致封闭不充分。4.提高封闭液中，脱脂奶粉或者BSA的浓度。一抗浓度过高1.调整抗体的稀释比。背景高抗体孵育温度过1.改变抗体孵育的方式（由原来的室温孵育改高为4℃孵育）。质检部南京巴傲得生物科技有限公司第3页共6页二抗与封闭剂非1设置阴性对照（不加一抗）。特异性结合或反2.降低二抗的孵育时

5、间（室温超过2h以，非特应异性结合大大增加）。1.更换合适的封闭液（有时候脱脂奶粉的效果封闭比较好）一抗或二抗与封2.当用脱脂奶粉封闭背景较高时，选择BSA进闭剂有交叉反应行封闭(脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景)。未结合蛋白质洗1.提高洗涤强度（洗涤的时间和洗涤的次数）涤不充分2.两次洗涤的过程中，尽量把TBST倒尽。1.由于NC膜和PVDF膜与蛋白结合的原理不膜的选择导致的同，选择合适的膜。（例如选择PVDF膜可以高背景增加洗膜强度）1.胶片曝光；2.显影液定影液失效；背景有黑色斑点3.显色时间太长；4.封闭液中牛奶

6、没有溶，有颗粒性成分。封闭后的实验操1.在孵育过程中防止膜变干，在任何步骤都保作过程中膜干燥证膜有充分的反应液。细胞传代次数过1.在使用细胞进行样品准备时，尽量选用传代多，使其蛋白表达次数少的没问题的细胞，传代次数多，有些蛋不同白可能发生表达的不同。质检部南京巴傲得生物科技有限公司第4页共6页体内表达的蛋白1.查阅相应的网站（例如：uniprot），查看相样本具有多种修应的转录本信息；饰形式如乙酰化、2.参考其他抗体的网站信息，查询目的蛋白的多带现象甲基化、烷基化、分子量，和表达情况；磷酸化、糖基化等3.选择合适的组织样本，检测相对应的转录本。1.提取的样品时间长，发生明显

7、降解；蛋白样本降解2.提取蛋白的时候，加入蛋白酶抑制剂。3.样品保存得当，尽量在室温的时间减少；一抗浓度过高，高1.增加一抗的稀释比例；浓度时常出现多2.降低一抗和二抗的孵育时间；条蛋白带1.一般二抗体系清楚，不调二抗的稀释比例，二抗浓度过高，高降低二抗的孵育时间；浓度产生非特异2.降低抗体浓度，增加二抗对照（不加一抗）；性结合3.选择适当的孵育时间，一般为室温60分钟，时间过长易出现非特异性的条带。1应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失；2.对于磷酸化的抗体，选择去磷酸化的样本作