实验三 革兰氏染色课件.ppt

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1、微生物学实验生命科学实验教学中心510室实验三革兰氏染色实验目的2.掌握细菌涂片和革兰氏染色基本程序。1.理解革兰氏染色的原理。革兰氏细菌的细胞壁结构实验原理革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的。在染色过程中，当用乙醇处理时，肽聚糖脱水而孔障缩小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色，用G+表示。实验原理革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而易被乙醇溶解的类脂质含量高。当用乙醇处理时，类脂质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被

2、乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液的颜色，因此呈现红色，用G-表示。实验器材（一）金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,土壤分离细菌。（二）革兰氏染色液：（结晶紫染液；Lugol碘液；95%乙醇；稀释石炭酸复红染液），载玻片，酒精灯，接种环，吸水纸，香柏油，擦镜纸等。（三）光学显微镜。实验步骤一、细菌涂片的制作取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴单蒸水，按无菌操作法取菌涂片，做成浓菌液。2.再取干净载玻片一块将刚制成的浓菌液挑2-3环涂在玻片两边制成薄的涂面，注意取菌不要太多。3.将玻片反复在酒精灯上方通过

3、几次（用手指触摸涂片反　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　面，以不烫手为宜），对标本进行干燥、固定（也可自然干燥）。待涂片冷却后，再加染色液。涂片制作1.初染：在涂片上加结晶紫（以盖满细菌涂面为宜），染色约1分钟后水洗。2.媒染：滴加Lugol碘液染色1分钟，水洗。3.脱色：把玻片上的水吸净，用95%酒精滴洗玻片，直到滴出的酒精刚好不出现紫色，大约20秒钟，立即用水洗。4.复染：滴加稀释石炭酸复红染液染色1-2分钟，水洗后涂片用吸水纸吸干或者放空气中晾干。二、革兰氏染色革兰氏染

4、色流程图(1)先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野。(2)将高倍镜转出，然后在涂片上加香柏油一滴。(3)将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的颜色和形态。三、涂片观察油镜工作原理金黄色葡萄球菌(10×40)大肠杆菌(10×40)四实验完毕后的处理：1.将浸过油的镜头按照下述方法擦拭干净：a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯（）将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。`注意擦镜头时向一个方向擦拭。2.镜检后的染色玻片用纸将香柏油擦干净。1.涂片后要注意固定

5、、干燥，以免标本被冲洗掉。注意事项2.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌。如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格界定。4.选用幼龄的细菌。选用培养16h-24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。3.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。实验结果菌名菌体颜色菌体形态（图示）G+或G-金

6、黄色葡萄球菌大肠杆菌土壤分离细菌实验思考1.为什么革兰氏染色后细菌会分出两种颜色？2.革兰氏染色最关键的是哪一步，此时阳性菌和阴性菌各应该是哪种颜色，不经过复染这一步能不能区别革兰氏阳性菌和阴性菌？3.固定的目的之一是杀死细菌，这与用自然死亡的菌体进行染色有什么不同?