基因工程基本操作定稿.ppt

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1、1.2基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因组文库受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。指满足人们需要，能编码蛋白质的结构基因。3.基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转

2、录形成mRNA逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库PCR技术—聚合酶链式反应原理：前提：条件：PCR扩增仪DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成_______b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部__

3、______。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a

4、、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因二、基因表达载体的构建1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是3.PCR技术扩增DNA,需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥4.细菌的质粒分子带有一个抗菌素

5、抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接5.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子B.终止密码C.标记基因D.目的基因目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达1.农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上2.转化（一）导入植物细胞（2）基因枪法（3）花粉管通道法三

6、、将目的基因导入受体细胞导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。显微注射技术含目的基因的表达载体动物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物显微注射分裂分化移植发育问题为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？（二）导入动物细胞（三）导入微生物细胞2.优点繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。3.常用受体细胞大肠杆菌（E.coli）1.过程（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌细胞壁通透

7、性增加，易于接受外源DNA分子。（2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。Ca2+处理法四、目的基因的检测与鉴定目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。（一）分子水平1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因提取受体生物全部DNA适当限制酶切割DNA片段用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已插入）分子杂交技术2.检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物

8、的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。3.检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术提取受体生物的蛋白质与相应抗体杂交显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（二）个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。归纳