行业标准：DB37T 3316-2018 鸡J-亚群白血病实验室诊断技术.pdf

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1、ICS65.020.30B45DB37山东省地方标准DB37/T3316—2018鸡J-亚群白血病实验室诊断技术LaborataryDiagnosticTechniqueofChickenLeukosisVirusSubgroupJ(ALV-J)2018-06-12发布2018-07-12实施山东省质量技术监督局发布DB37/T3316—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。本标准主要起草单位：山

2、东农业大学。本标准主要起草人：成子强。IDB37/T3316—2018鸡J-亚群白血病实验室诊断技术1范围本标准规定了我省针对ALV-J的检测诊断方法。本标准适用于判断鸡群是否患J亚群白血病。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1禽白血病病毒J亚群AvianLeukosisVirusSubgroupJ.ALV-JALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属，是单股正链RNA病毒。ALV-J主要特点是引起多种禽类免疫抑制和髓细胞性白血病发生，对养鸡业威胁巨大。2.2抗原/抗体检测通过标准的酶联免

3、疫吸附实验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）检测ALV-J的抗原/抗体。应用指定的商品化ALV-J抗原/抗体检测试剂盒，用血清检测ALV-J抗体，用棉拭子检测ALV-J群特异性抗原（p27）具体实验步骤参照GB/T26436。抗体及p27均呈阳性，或二者之一呈阳性，可怀疑ALV-J感染。2.3PCR聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)。2.4RT-PCR反转录-聚合酶链反应（reversetranscriptionPCR，

4、RT-PCR）。3材料与试剂3.1常规使用的ELISA抗原/抗体检测试剂盒(IDEXX)。3.2常规使用的商品化的RNA提取试剂盒。3.3常规使用的商品化的RNA反转录试剂盒。3.4各检测方法所需的试剂。3.4.1PBS缓冲液见附录A中A.1。3.4.2灭菌水。1DB37/T3316—20183.4.3蒸馏水。3.4.4细胞生长培养基见附录A中A.2。3.4.5细胞维持培养基见附录A中A.3。除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。4仪器与设备4.1全自动高温高压灭菌锅(温度范围：105-134℃；

5、额定压力：0.23Mpa)。4.2低速离心机。4.3PCR仪。4.4二氧化碳恒温细胞培养箱。4.5液氮储存罐。4.6研磨器。4.7手术剪。4.8各量程移液枪。4.9超低温冰箱。4.10酶标仪。4.11分光光度计5抽样5.1样品采集5.1.1组织样品的采集按1%的比例，随机选取疑似J亚群禽白血病病鸡，用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器100mg分装于1mL储存管内，并及时冻存于-80℃冰箱或液氮罐内备用。5.1.2血液样品的采集用2.5mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取1mL左右的静脉血，

6、放入编号离心管内，倾斜静置，待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内，储存于-20℃冰箱备用。5.1.3泄殖腔棉拭子的采集用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有1mLPBS缓冲液的离心管内，储存于-20℃冰箱备用。5.2样品运输与存放采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输，然后上述要求及时放入液氮罐或-80℃冰箱或-20℃冰箱储存。6操作方法6.1方法2DB37/T3316—20186.1.1抗原/抗体检测抗原/抗体检测是采用美国IDEXX公司的ELISA检测试剂盒检测。6.1.1.1样品

7、处理检测样品前，棉拭子应反复冻融2次～3次，4℃，1006.2×g（3000转）离心2min～3min，吸取上清。血清样品于室温融化，500倍稀释，用于检测。6.1.1.2操作步骤按照试剂盒提供的检测步骤操作。6.1.1.3结果判定只要p27抗原和ALV-J抗体其中之一为阳性，需要进行下一步检测。6.1.2RT-PCR检测通过对疑似病例组织RNA提取，反转录为cDNA作为模板进行特异性PCR检测。6.1.2.1RNA及cDNA提取将冻存于液氮罐内的组织用商品化试剂盒提取RNA，用分光光度计测浓度后

8、用商品化试剂盒反转录成cDNA。RNA储存于-80℃冰箱，cDNA储存于-20℃冰箱。6.1.2.2操作步骤先完成RNA提取，具体操作按照试剂盒提供的步骤即可，测定浓度，然后将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用ALV-Jgp85片段的特异性扩增进行PCR扩增，扩增产物于120V电压，1%琼脂糖凝胶电泳检测。剩余的RNA保存于-80℃冰箱，cDNA保存于-20℃冰箱。具体反应条件见附录B。6.1.2.3结果判定琼脂糖凝胶电泳中出现特异的545bp的片段条带时，进行下一步检