生物信息学常用软件简介-引物设计课件.ppt

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1、生物信息学常用软件简介-引物设计提纲PCR简介常用引物设计软件primer5.0Oligo6.0注意事项PCR(PolymeraseChainReaction)一、聚合酶链反应简介1983.4KaryMullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwoodcountry的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR随后卖给了Roche公司价格：10.000$1993Nobelprize历史PCR反应体系的五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+TaqDNA聚合酶-来自水生栖热菌(Thermusaquaticus)

2、良好的耐热性Mg2+依赖性无校读功能PCR反应体系的准备+primers+nucleotides+Taqpolymerase(Thermusaquaticus)+salts(ions)+DNAfragmentPCR的基本原理变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物PCR三步曲变性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右PCR过程何为PCR引物？引物(primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互

3、补。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物的重要性在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。PCR引物设计一般原则一对引物，分别与5′和3′端互补长度：15～30个核苷酸引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性引物设计要求引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物的内部

4、稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构引物长度一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。引物Tm值一般要求：55℃-65℃。计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最

5、近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物二级结构引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3’端引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一

6、个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物5’端引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。引物的内部稳定性过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性

7、结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。引物的保守性与特异性保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增扩增区域的二级结构模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差

8、一般不超过30℃引物与PCR引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L退火温度最适退火温度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。PCR引物设计主要工具参考文献在线引物设计程序：primer3.0美国生物医学研究所基因组学研究中心引物设计软件：primerprimer5引物设计和评估软件：Oligo6PrimerPremier5.0简介Premi