实验室血清学常用检测方法.doc

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1、常用血清学检测方法介绍一、酶联免疫吸附试验诊断技术目前，该项技术已在兽医学上得到广泛的应用，大多数动物传染病都已经研制成ELISA检测方法。1、酶联免疫吸附试验的原理ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通

2、过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。2、ELISA的类型根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于动物疫病检测的ELISA主要有以下几种类型：①.双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。在临床检验中，此法适用

3、于检验各种蛋白质、微生物病原体第二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如猪瘟病毒检测ELISA、禽流感病毒抗原捕获ELISA，就是根据这种原理设计的。②.双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。乙肝HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，需要根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因

4、此其敏感度相对高于于间接法。此外，该方法不受被检动物种属差异的限制。③.间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗体（抗免疫球蛋白抗体），检测与固相抗原结合的受检抗体（见图1）。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但

5、一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。（4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法在动物疫病抗体检测中应用广泛，例如禽流感的间接ELISA，用禽流感病毒NP蛋白包被成抗原板，待检血清中的抗体与之结合，再加酶标二抗反应，可以检测所有A型禽流感病毒抗体。④.竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质

6、不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争固相抗原。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。⑤.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和固相抗原共同竞争一定量的酶标抗体。标本中抗原量含量愈多，结合到固相上的酶标抗体愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。例如，猪瘦肉精的检测，多用

7、瘦肉精抗原包被反应板，让样品中的瘦肉精抗原和板上的抗原共同竞争酶标单克隆抗体。目前，已有商品化、标准化的试剂盒，可检测猪瘟、猪伪狂犬、猪蓝耳病、猪乙型脑炎、猪细小病毒、猪圆环病毒、猪弓形虫、猪喘气病等各种抗体。（二）琼脂扩散试验1、基本概念沉淀反应：是利用可溶性抗原与抗体结合，形成肉眼可见的沉淀的一类血清学免疫反应。抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。如细菌内毒素、外毒素、菌体裂解物，病毒悬液、病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等。沉淀试验包括絮状沉淀试验、琼脂扩散试验、免疫电泳。琼脂扩散试验：是一种

8、运用沉淀反应原理进行兽医诊断检测的一种常规实验方法。2、基本原理琼脂扩散试验是利用抗原抗体能在琼脂凝胶中自由扩散，并在琼脂中结合，在一定比例处凝聚形成沉淀线，从而对抗原或抗体进行的测定、比较、鉴定和检测。该方法具有简便易行的特点，不需使用大量昂贵仪器设备，易于操作而被广泛采用。琼脂扩散试验分为四种类型：单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散。其中应用最广的是双向单扩散和双向双扩散，双向单扩散主要用于对抗原抗体的定量测定，双向双扩散主要用于对抗原的比较，以及抗原抗体的检测。双