病原物地分离与培养.doc

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1、病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的

2、培养。－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。(一)热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量

3、越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2h。但干热灭菌温度不能超过180℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，

4、以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱停止加温；电烘箱温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。2湿热灭菌(1)高压蒸汽灭菌此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅，0.1MPa，121℃保持15～30min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。(2)常压蒸汽灭菌在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌

5、的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器，每天加热100℃，30min，连续3d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。(

6、二)过滤除菌许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：(1)蔡氏过滤器该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。(2)微孔滤膜过滤器这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合

7、物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：①组装、灭菌将0.

8、22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作