DB32∕T 906-2006 动物饲料和饮用水中己烯雌酚的测定 酶联免疫法.pdf

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1、ICS65.020.01B46备案号：18651-2006DB32江苏省地方标准DB32/T906—2006动物饲料和饮用水中己烯雌酚的测定酶联免疫法DeterminationofDiethylstilbestrolinanimalfeedingstuffsandwaterbyELISA2006-03-25发布2006-05-25实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T906—2006前言为了加强对己烯雌酚的有效监控，进一步规范畜禽养殖中投入品的管理，特制定本标准，以从源头上监控己烯雌酚的非法使用，从而保证畜产品的安全和人民身体健康。本标准按照GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分

2、：标准的结构和编写规则》和GB/T1.2-2000《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》编写。本标准由江苏省农林厅提出。本标准起草单位：江苏省饲料监察所。本标准主要起草人：耿士伟、时勇、邵德佳、毕昊容、冯三令、储瑞武、贾书静。DB32/T906—2006动物饲料和饮用水中己烯雌酚的测定酶联免疫法1范围本标准规定了动物饲料和饮用水中己烯雌酚（DES）酶联免疫法测定的原理、试剂和材料、仪器、试样分析、允许差。本标准适用于酶联免疫法测定动物饲料和饮用水中己烯雌酚的量。方法最低检出限为5μg/kg。2原理测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对兔IgG（己烯雌酚抗体，简称D

3、ES抗体）的羊抗体。加入DES抗体，标准或样品溶液。己烯雌酚与DES抗体连接，同时DES抗体也与羊抗体连接。洗涤步骤后，加入DES酶标记物，DES酶标记物与孔中的未结合的（空位）DES抗体连接，然后在洗涤步骤除去未结合的DES酶标记物。将酶基质和发色剂（四甲基联苯胺）加入到孔中并且孵育。结合的DES酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转变为黄色。在450nm处测量，吸收光强度与样品中的DES浓度成反比。3试剂和材料3.1甲醇，分析纯。3.2滤纸，定性滤纸。3.380%甲醇水溶液：量取80mL甲醇，加入蒸馏水至100mL。3.440%甲醇水溶液：量取40mL甲醇

4、，加入蒸馏水至100mL。4仪器4.1恒温培养箱。4.2粉碎机。4.3振荡器。4.4酶标仪。4.5微量移液枪：单道1mL～5mL可调、10μL～100μL可调和多道50μL～250μL可调。5试样分析5.1样品提取5.1.1饲料称取2.0g粉碎后的饲料于50mL离心管中，加入80%甲醇水溶液20mL于振荡器上振荡3min，滤纸过滤后取滤液1mL，加入1mL蒸馏水稀释。取稀释液1mL，加入40%甲醇水溶液9mL，摇匀，供酶联免疫吸附测定用。5.1.2饮用水直接量取1mL，加入40%甲醇水溶液4mL，摇匀，供酶联免疫吸附测定用。5.2测定使用前将试剂盒及处理后的试样在室温（20℃～24℃）下放置

5、1h～2h回温。5.2.1将标准和试样（按双平行实验计算）所用数量的孔条插入微孔架，记录标样和试样的位置。加入20μL标样以及处理好的样品液到各自的微孔中。标样和样品做两个平行实验。1DB32/T906—20065.2.2加入50μL稀释后的DES抗体到每一个微孔中。在平面上做圆周运动以充分混后并覆盖上薄膜，在2℃～8℃孵育20h。5.2.3倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3次），以充分除去孔中的液体。用250μL样品洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉孔中液体，再重复两次上述操作。5.2.4加入50μL稀释的酶标记物到微孔底部，在平面上做圆周运动以充分混合，室温孵育1h，覆盖上

6、薄膜。5.2.5倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3次），以充分除去孔中的液体。用250μL样品洗涤缓冲液充入孔中，再次倒掉孔中液体，再重复两次上述操作。5.2.6加入50μL基质和50μL发色剂到每一个微孔中，充分混合并在室温暗处孵育30min。5.2.7加入100μL反应终止液每一微孔中，混合好在450nm处测量吸光值。5.3结果计算用所获得的标样和试样溶液吸光度值与空白溶液的比值按式（1）计算：BR（%）＝×100………………………………………………（1）B0式中：R——相对吸光度值；B——标样（或试样）溶液的吸光度值；B0——空白（浓度为0的标准溶液）的吸光度值。将

7、计算的相对吸光度值（%）对应的己烯雌酚（DES）浓度（ng/L）的自然对数作半对数坐标系统曲线图，校正曲线在50ng/L～200ng/L内呈线性，对应的试样浓度可从校正曲线算出。试样中己烯雌酚的量按式（2）计算。A׃X＝……………………………………………………（2）m×1000式中：X——试样中己烯雌酚（DES）的含量，单位为微克每千克或微克每升[μg/kg(μg/L)]；A——试样的相对吸光度值（%）对应