树舌胞外多糖分离纯化实验方案1

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1、透析一、透析袋的前处理1．把透析袋剪成适当长度（20cm）的小段，将透析袋煮沸10分钟。2．用蒸馏水彻底清洗透析袋。（以后的每步操作必须戴一次性手套）3．冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。4．用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。二、透析的步骤将多糖溶液浓缩（用旋蒸仪浓缩）后，高速离心8000rpm，4℃下10分钟，装入透析袋中，排出空气，用棉线扎口。悬挂在清水容器中，于4℃用蒸馏水透析48h。取出，冻干保存。离子交换纤维素DEAE－52柱层析1、纤维素预处理：蒸馏水浸泡3～5h，抽滤，0.5mol·L－1NaOH溶液浸泡3～5h，抽滤，NaOH溶液洗

2、涤2～4次，蒸馏水清洗至中性，0.5mol·L－1HCl溶液浸泡3～5h，抽滤，HCl溶液洗涤2～4次，蒸馏水洗至中性，0.5mol·L－1NaOH溶液浸泡，抽滤，NaOH溶液洗涤2～4次，蒸馏水清洗至中性，溶解待用。2、装柱：将处理好的纤维素溶于洗脱液中，浸泡3h后抽滤。再次溶解，拌匀后用玻璃棒贴层析柱内壁引流（避免出现气泡）装柱，用0.02mol磷酸盐缓冲液稳定12h左右。3、上样：透析后的多糖溶液上纤维素DE-52层析柱，用0.2mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，恒流泵控制流速约为1.4rpm（每分钟20滴），每管5mL收集。（收集后测试试管内是

3、否有多糖，苯酚-硫酸法，2滴溶液+1滴6%苯酚+5滴浓硫酸，于显色皿观察，收集显黄褐色的试管溶液）苯酚-硫酸法：吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。样品处理：将收集的样品浓缩到约50ml后，高速离心8000rpm，4℃下10分钟，再次透析（方法同上），收集样品于100ml烧杯，置于真空干燥箱干燥24~48h，取出样品，置于干燥器中待用试剂的配制1、0.5mol/LNaOH0.5mol/LHCl2、0.2mol/L、0.5mol/LNaCl（58.44×0.2=11.688

4、g/L58.44×0.5=29.22g/L）由相对应质量NaCl溶于0.02mol磷酸盐缓冲液配的3、6%苯酚6g苯酚溶于100ml蒸馏水4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）磷酸氢二钠0.2mol/LNa2HPO472ml+磷酸二氢钠0.2mol/LNaH2PO428ml使用时稀释10倍。M（Na2HPO4）=0.2*184*0.072=2.9664gM(NaH2PO4)=0.2*184*0028=1.0304g