生物分离纯化与技术

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1、组员：严帆，周小东，罗双，南蒙，任秋阳生物分离与纯化技术课题：猪胰蛋白酶的分离纯化猪胰蛋白酶的分离与纯化主要内容：一、胰蛋白酶的基本特性二、采用的分离纯化方法的原理1.沉淀法2.透析法3.离子交换层析技术4.亲和层析法(进一步纯化）三﹑胰蛋白酶的分离纯化四﹑蛋白质含量的测定五﹑酶活力的测定一、胰蛋白酶的基本特性胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为

2、有活性的胰蛋白酶。猪胰蛋白酶的分子量约为23.4kDa，其等电点约为pI=10.8，最适pH7.6～8.0，胰蛋白酶在pH=3左右较稳定，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。二、分离纯化应用的一些方法原理盐析沉淀法：用硫酸铵盐析法将目的蛋白从粗提液中沉淀出来，使其得到浓缩，并除去部分杂质（核酸、杂蛋白等）。1.沉淀法二、分离纯化方法的原理由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓度差的作用下，高分子溶液（如蛋白溶液）中的小分子溶质（如无机盐）透向透析液一侧，同时透

3、析液中的缓冲液渗入蛋白溶液一侧，经过透析液反复换液后，即可达到脱盐和置换缓冲液的目的。2.透析法二、分离纯化方法的原理同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。蛋白质在其等电点以下（pHpI），带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附。本实验中的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰蛋白酶带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附（本实验采用CM-纤维素离子交换树脂）；而带负电荷的杂蛋白不被吸附而除去，带正电

4、荷的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱的蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。通过以上离子交换层析法，即可将目的蛋白和杂蛋白分开，从而得到纯化。3.离子交换层析法二、分离纯化方法的原理4.亲和层析法:亲和层析是由吸附层析发展起来的，主要是根据生物分子与特定的固相化配基（ligand）之间的亲和力而使生物分子得到分离的。所谓亲和力是指：范德华力、疏水力、静电力、氢键等，

5、它存在于某些分子内部，也是维系着某些分子之间的结合力。酶与底物、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体等彼此分子之间的结合力就是亲和力。亲和力是很弱的，只有在彼此分子挨得很近的条件下才显示出来。所以要求两分子之间的结合具有高度特异的分子基础，即分子间的互补结构。利用这种具有亲和力的生物分子间可逆的结合和解离的原理发展起来的层析，就称为亲和层析。一、猪胰蛋白酶的分离纯化（1）粗猪胰蛋白酶的提取（2）透析（3）离子交换法纯化猪胰蛋白酶(4)亲和层析法纯化猪胰蛋白酶1.粗猪胰蛋白酶的的提取加5倍体积预冷

6、的PH2.5乙酸酸化水取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50ɡ用组织捣碎机捣碎用4层纱布过滤得上清液将研细的固体无水氯化钙慢慢加入原酶溶液中，边搅拌均匀，使溶液最终含有0.1mol/LCaCl2加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg),轻轻搅拌均匀用5mol/LNaOH调PH8.0于25℃活化4-6小时（2小时取样一次），测定酶活性增加的情况活化完成后，用2.5mol/L硫酸，调节PH至2.5-3.0量取体积，加入固体硫酸铵达到75%饱和度，静置过夜↓沉淀为粗胰蛋白酶↓↓↓↓↓↓↓离心1000

7、0rpm,15min(收集约1.5ml,作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化)离心10000rmp,15min←收集约为1.5ml,作为样液2，测量蛋白含量，及时SDS化∕一、猪胰蛋白酶的分离纯化将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001mol/LHCl溶液中（用2mol/LHCl调蒸馏水pH至3即可！）。在4℃下对0.001mol/LHCl溶液透析3小时左右（每小时换液1次！）而后改用0.01mol/L,pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析（至少换液3次，第一次1小时后换液，第二次是2小时后换液，第三次是3小

8、时后换液，然后过夜透析！）（记录样品体积，收集约1.5mL，作为留样3，测蛋白含量，及时SDS化）（2）透析恒流泵部分收集器离子交换柱离子交换流程简图一、猪胰蛋白酶的分离纯化（3）离子交换层析法纯化猪胰蛋白酶离子交换层析法初步纯化猪胰蛋白酶柱的平衡：用0.01mol/L,PH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱样品吸附：直接上样于CM-纤维素离子交换柱洗涤：用0.01mol/L，PH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白洗脱1：用0.01mol/L,PH5.0柠檬酸钠缓冲