免疫双向扩散实验.doc

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1、双向扩散法—抗原分析【原理】    双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。【材料】   生理盐水1%琼脂管（每管约4ml）   载玻片   打孔器及打孔模板   微量加样器及塑料吸头   抗体及抗原1、2、3、4、5、6。   湿盒【方法】1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5~4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。3．凝固后

2、，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。4．用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。5．作好记录，放湿盒

3、中，置37℃温箱，24小时后观察结果。【结果】  说明：（1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。（2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。（3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。单向免疫扩散法（Single radil immunodiffusion）—正常人群IgG正常值检测【原理】    在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准

4、曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/ml或IU/ml）。   应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA及IgM的含量及正常值。【材料】1．示教部分：   2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2‰NaN3）   标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）   参考蛋白工作标准（北京生物制品研究所生产）   pH7.2 PBS   玻璃板或载玻片。   打孔器（孔径3mm）及打孔模板。   微量加样器   湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）2．实验部分：   已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板。   1:50稀释的单人份待检血清标本。   打孔器、模

5、板、微量加样器及湿盒等。【方法】（一）标准曲线的制备：示教1．按照玻片的大小，以能制做1~1.5mm厚度的琼脂板的量，分装其1/2量的2%盐水琼脂。例如，用普通载玻片制做时其1%琼脂量为4ml，在分装2%盐水琼脂时既为2ml。溶化后置56~60℃水浴中平衡温度备用。2．稀释抗体：将标准抗人IgG抗体按其效价用pH7.2 PBS做成1倍稀释。例如，血清效价为1:140，原浓血清既应稀释为1:70。并分装试管，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。3．制板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持56~60℃的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管1~2次，将

6、抗体与琼脂混合均匀（注意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），迅速倾注于玻片上，待凝固后既制成。4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。5．稀释不同浓度的参考蛋白标准（工作标准）：应根据制品说明进行稀释，例如：工作标准中免疫球蛋白含量，IgG为100单位/ml，80.4微克/单位，其稀释范围为1:10、1:20、1:40、1:80及1:160。6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准顺序用微量加样器每孔加入10μl（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。7．置湿盒中，放37℃温箱，24小时后观察结果。8．用量角规测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，不

7、同单位/ml为横座标，绘制成标准曲线。   在制做标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。（二）正常人血清中IgG值的测定：1．将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm，孔距10mm）。2．将单份正常人血清用pH7.2 PBS分别作1:50稀释。3．用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本10μl加入孔中，每份标本应各加两孔（每份标本均应更换塑料吸头）。4．作好标记置湿盒中，放37℃温箱