实验 聚丙烯酰胺.ppt

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1、实验聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白11级医学检验四小组实验目的掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理熟悉盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术实验原理以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的电泳技术是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的，催化剂为过硫酸铵(AP)，加速剂为四甲基乙二胺TEMED,形成三维网状凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。Bis：交联剂过硫酸铵(AP)

2、：引发剂，提供自由基，引发聚合反应四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂,加快引发释放自由基的速度三大效应聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。1.浓缩效应分离机制：凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7；分离胶pH=8

3、.9电位梯度不连续缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电位梯度的不连续性：电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。成分pH值孔径电泳

4、缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率=迁移率解离度2.分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。3.电荷效应电荷量不同，迁移率不同。实验仪器电泳装置稳压电源盘状电泳槽毛细滴管刻度吸量管玻璃管和橡胶帽微量移液器注射器和长针头脱色摇床试剂Acr和Bis：棕色瓶保存TEMED-

5、四甲基乙二胺，避光保存。过硫酸铵(新鲜配制)染色液：0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。贮存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比11NHCl48.Oml；Tris36.6克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号；凝胶浓度7％；pH=8.92Acr28.0克；Bis0.725克3过硫酸铵0.14克41NHCl48.Oml；Tris5.98克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：1份4号，2份5号；抽气后加入4份6号；凝胶浓度2

6、.5％；pH=6.75Acr10.0克；Bis2.5克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管1准备每人取电泳管1支，并在距电泳管下端7cm和7.5cm处画横线做标记，加1-2滴40％蔗糖于橡胶帽内堵住电泳管底部，塞紧。实验步骤试剂分离胶溶液（ml）浓缩胶溶液（ml）分离胶缓冲溶液（pH8.9）1.25—浓缩胶缓冲溶液（pH6.7）—1.25单体交联剂2.51.0DDW6.197.65催化剂（10%AP）0.100.10TEMED0.02

7、0.02成胶时间30min15min浓度7.5%(孔小)3%（孔大）2制胶(取小烧杯2个,按表加液)按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管7cm处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合20-30min；待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再滴加蒸馏水一滴，静置15min左右。浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气使用。3灌柱4样品液制备：血清:0.1ml40%蔗糖:0.1ml0.05%溴酚兰:0.1m

8、l添加于一个小试管中混匀备用5装电泳管和上样将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡,然后在上层添加缓冲溶液覆盖凝胶管上端，除气泡。加样品液10μl至浓缩胶面。6电泳上槽——负极（黑）下槽——正极（红）电流：先浓缩胶:1.5mA/管然后分离胶:3.0mA/管7剥胶电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和