深圳大学理科选修《遗传学发现》课件 7 重组dna

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1、重组DNA大肠埃希菌俗名大肠杆菌是人和动物肠道中最主要的细菌之一是正常菌群的成员出生后数小时就进入肠道，并伴随终生能合成维生素B和K，供人体利用能抑制腐败菌及病原菌（如金黄色葡萄球菌、志贺菌属）真菌（如白念珠菌）的过度增殖异位寄居时可引起肠外感染某些菌株有致病性—消化道感染，导致腹泻等每个人每天平均从粪便中排出1011到1013个可作为粪便污染的检测指标常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究基因工程的工具菌生物学性状形态与染色G-杆菌，1~3µm（短杆菌）两端钝圆、无芽孢有周鞭毛有普通菌毛/性菌毛能运动卫生细菌学检查大肠菌群指37OC24h内发酵乳糖产酸产气包括埃

2、希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属及肠杆菌属等大肠菌群指数指1000ml被检样品中的大肠菌群数生活饮用水的水质标准coli-index≤3个我国2007年开始实施的卫生标准规定每100ml生活饮用水中，不得检出总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠埃希菌1、细菌培养--平板培养划线法培养涂布法培养大肠杆菌的培养限制性内切酶EcoRI内切酶限制性内切酶:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。分子剪刀沃纳•阿尔伯1929年生于瑞士。苏黎士工科大学毕

3、业后，在日内瓦大学获得博士学位。1971年起，任巴塞尔大学教授。在研究噬菌体的遗传现象时，成功地分离出DNA的限制性酶和甲基化修饰酶，为此获1978年诺贝尔生理学医学奖。限制—修饰现象Kλ（B）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体第一次感染K菌株，形成的噬菌斑很少，生长受寄主限制Kλ（K）存活下来的噬菌体再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制EOP:Efficiencyofplating（生长在不同寄主中的λ噬菌体的成斑率，表示限制程度）说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA；10-4的存活率是由宿主限制系统作用的结果产生这种现象的原

4、因何在甲基化酶：能使细胞自身核酸的内切酶识别序列的碱基甲基化，从而使自身核酸免受内切酶水解——细菌的“防御”系统核酸内切酶：识别并水解外源DNA（外来核酸在内切酶识别序列上没有甲基化修饰作保护）研究发现：原来是由两种酶配合完成，一种是起修饰作用的甲基化酶，另一种是核酸内切酶限制修饰限制—修饰体系Kλ（B）λ（K）λ（B）：能够在大肠杆菌B菌株上生长的λ噬菌体Kλ（K）再次感染K菌株，则形成的噬菌斑很多，不受限制（K菌株已经对其进行了修饰）λ（B）噬菌体感染大肠杆菌K菌株后，其DNA大部分被内切酶降解了，但有极少部分能在特定序列甲基化，避免被酶解，因此有少量噬菌斑

5、形成。在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA（如噬菌体DNA等），使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而宿主细胞自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。限制—修饰体系，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维持自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。分类核酸外切酶核酸内切酶核酸酶从核酸链的一端开始，一个接一个地消化降解核苷酸从核酸链分子内部切割3’，5’磷酸二酯键，使之断

6、裂形成小片段核酸内切酶：按限制性酶的组成、限制和修饰活性、切断核酸的情况不同，分三类（I，II，III），通常指的是II型。命名法HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶如从流感嗜血杆菌d菌株（Haemophilusinfluenzaed）先后发现3种限制性酶，则分别命名为HindI，HindII，HindIII大肠杆菌R菌株REscherichia嗜血流感杆菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名（型号）种名的头两个字母宿主属名的第一个字母coli前3个字母代表来源的生物随后1个字母或阿拉伯数字代表菌株最后1个罗马字母代表

7、发现或鉴定的次序基本特征识别并切割双链DNA（环状或线状）分子中4-8bp的特定序列结构特征：旋转对称的回文结构切割后产生的末端：CohesiveterminusorBluntend（粘性末端或平末端）EcoRI的识别序列5’…GCTGAATTCGAG…3’3’…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的切割位点质粒质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1~200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制

8、和转录要依赖于宿主细胞编