酶工程2微生物发酵产酶.ppt

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1、第二章微生物发酵产酶本章内容酶的发酵生产的概念——→优良菌种的筛选——→发酵的基本类型——→发酵工艺过程及条件控制*酶的生物合成模式在酶制剂发展的早期，酶多是从动植物原料中提取的。但是由于它们的生长周期长，酶在动植物组织中的含量低，又受地理、气候和季节等因素的影响，来源受到限制，不适于大规模的工业生产，因此除了部分用于医疗、疾病诊断及食品工业的酶外，目前基本都是以微生物作为生产酶的酶源，产酶微生物的发酵技术在酶生产中是极为重要的。发展微生物作为酶生产的来源主要有以下原因：①微生物生长繁殖快，生活周期短，产量

2、高。②微生物培养方法简单。③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。④微生物有较强的适应性和应变能力。经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需的酶的过程，称为酶的发酵生产。首先必须选择合适的产酶菌株然后采用适当的培养基和培养方式进行发酵，使微生物生长繁殖并合成大量所需的酶最后将酶分离纯化，制成一定的酶制剂。第一节优良产酶菌种的筛选酶的发酵生产的前提之一，是根据产酶的需要，选育到性能优良的产酶细胞。优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，筛选符合生产需要的菌种

3、是发酵生产酶的首要环节，一个优良的产酶菌种应具备以下几点：a繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期。b容易培养和管理，能在便宜的底物上良好生长。c产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭。d产生的酶容易分离纯化。e安全可靠、无毒性。不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，才能确保酶生产和应用的安全。产酶菌种的筛选方法与发酵工程中微生物的筛选方法一致,主要包括以下几个步骤:含菌样品的采集,菌种分离,产酶性能测定及复筛等。1、含菌样品的采集：要获得产生某酶的菌种可从富含该酶作用底物的场所去采集含菌

4、样品。2、富集培养：一般的菌样含所要分离的微生物量很少时，富集培养有利于某种产酶菌种的筛选。3、菌种纯化：生产菌在自然条件下通常是与各种菌混在一起的，所以要进行分离、纯化，这样才能获得纯种。纯化时一般采用稀释法和划线法。4、产酶性能测定：将酶的底物和培养基混合倒入培养皿中制成平板，然后涂布含菌的样品，如果长出的菌落周围底物发生变化，即证明它产酶。如果是胞内酶，则可采用固体培养法或液体培养法来确定。固体培养法是把菌种接入固体培养基中，保温数天，用水或缓冲液将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌；液体培养

5、法是将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床上振荡培养一段时间（视菌种而异），再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。5、高产菌株的选育目前，优良菌种的获得一般有三条途径：一是从自然界分离筛选；二是用物理或化学方法处理、诱变；三是用基因重组或细胞融合技术。5、常用的产酶微生物（1）细菌大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。大肠杆菌可生产多种酶，如，谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内

6、切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。枯草杆菌：用途很广，可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。（2）放线菌链霉菌：生产葡萄糖异构酶的主要微生物（3）霉菌黑曲霉：生产糖化酶、α-淀粉酶、果胶酶、酸性蛋白酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶等米曲霉：生产糖化酶和蛋白酶，在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉（4）酵母啤酒酵母：主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产假丝酵母：单细胞蛋白的主要生产菌第二节酶的生

7、产方式按发酵方法可分为：一、固体发酵法（传统方法）固体培养发酵的培养基，以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经灭菌、冷却后，加入产酶菌株，在一定条件下进行发酵。主要用于真菌的酶生产，其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠久历史。我国传统的各种酒曲、酱油曲等都采用这种方式进行生产，其主要目的是获得淀粉酶和蛋白酶。优点：设备简单，操作方便，麸曲中酶浓度较高，特别适用于各种霉菌的培养和发酵产酶。缺点：劳动强度较大，原料利用率较底，固体发酵条件控制不易均

8、匀，生产周期较长。二、液体深层通气发酵法（最广泛应用）采用液体培养基，置于发酵容器中，经灭菌、冷却后接入产酶细胞，在一定条件下进行发酵。液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。优点：⑴不仅适用于微生物细胞，也可用于各种植物细胞和动物细胞的悬浮培养和发酵。⑵机械化程度较高，技术管理较严，酶产率较高，质量较好，产品回收率较高。⑶易于为人为控制。三、固定化细胞或固定化原生质体发酵1、固定化细胞发酵（70年代后期发展起来