生化工程 测试题三.doc

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1、生化工程（生物化学技术原理与应用）测试题三1.双向电泳（第六章，书P347）双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pＨ梯度分离至各自的等电点。随后，再沿垂直的方向进行SDS-PAGE，按照分子量大小进行分离。特点：分辨率高；高重复率。应用——蛋白质组学。（书：在一个复杂的混合样品中，若其中某些物质的等电点或分子质量相似，或等电点和分子质量有互补作用时，用单向凝胶电泳将所含组分全部分开是不能奏效的。所以常常要把第一向电泳胶条转至另一种凝胶介质（pH和浓度与一向电泳胶不同）上进行第二向电泳，才能使混合样品得到有效分离。在双向电泳中，若第一和第二向电泳的缓冲液p

2、H相差很大时，第一向电泳的凝胶条（或柱）要在第二向分离胶的缓冲液（或指定的平衡液）中浸泡平衡，使其离子强度和pH均与第二向凝胶基本相同。此外，就双向电泳的凝胶浓度而言，一般第一向比第二向低。）2.膜分离（第五章）（1）膜分离技术：在分子水平上，不同粒径的混合物在通过分离膜时实现选择性分离的技术。其实质是物质透过或被截留于膜的过程，类似于筛分过程，即依据膜孔径的大小而达到物质分离的目的。（2）特点：①物质在膜分离过程中不发生相变；②具有浓缩和纯化双重功效，选择性较高；③常温下进行，由压力驱动，特别适合热敏物质；④分离装置简单，操作容易。（3）膜分离与过滤的区别：①截

3、留分子大小有区别：过滤属于固液分离，被截留相为固体；膜分离既可截留胶体，亦可截留溶质。①分离率：膜分离为绝对过滤，滤液质量高③容易污染。3.膜污染（第五章）膜污染：在膜过滤过程中，由于浓度差极化、大颗粒溶质的吸附和吸附层的聚合三种情况下所导致的膜的通透流量与分离特性发生不可逆变化的现象。膜污染的特点：膜通透量下降，通过膜的压力和膜两侧的压力差逐渐下降，分离物的截留率下降。4.如何减少膜污染（第五章）改善膜污染的方法：（1）样品处理：料液进行预处理，除去较大颗粒；调节pH远离蛋白质等电点。（2）采取错流操作并增加紊流器。（3）控制溶液温度、流速、流动状态、压力等。（

4、4）膜组件的清洗：物理清洗/化学清洗。5.SDS-page测定蛋白质分子量的基本原理。（第六章，书P354-355）（蛋白质迁移与蛋白质分子量有关。因为消除了结构影响，定量↓…，…定量结合。）SDS（十二烷基磺酸钠）是阴离子表面活性剂，以单体和分子团的混合形式存在于水中，能以一定的比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质胶束物。此物可在具有SDS的聚丙烯酰胺凝胶（包括连续的和不连续的系统）电泳中进行分离，通常把这种电泳称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）。它的主要用途是测定蛋白质亚基的分子质量和鉴定其纯度及组分。（书：基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳

5、（PAGE）能有效地分离不同类型蛋白质的主要依据是，样品中各种物质的电荷和分子质量两方面的差异性；而SDS-PAGE分离样品的重要理由，则是样品中各种物质仅在分子质量方面的差异性。因为SDS能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，并破坏了其分子的折叠，进而改变了其空间立体结构。当解聚的蛋白质或肽键上的氨基酸侧链与SDS充分结合后，形成的SDS-蛋白质胶束物会带有大量负电荷，其负电荷量远远超过了原来的电荷量，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别明显缩小乃至小到可以忽略不计的程度。另外是SDS-蛋白质胶束物在水溶液中结构较松散的两端椭圆的棒状结构，其宽度基本相同，其长度则与分子

6、质量成正比。所以各种SDS-蛋白质胶束物在电泳时产生的迁移率差异，就反映出其分子质量大小的区别。试验证明在此条件下，样品中蛋白质分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈反比关系。一般用下式表示：lgM=a－bRf，式中，M代表分子质量；a代表常数；b代表斜率；Rf代表迁移率。再者，SDS-蛋白质胶束物在强还原剂（如巯基乙醇）存在下，已打开的蛋白质分子内或肽链间的二硫键，能避免重新氧化，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。蛋白质结合SDS的数量受溶液pH、离子强度和缓冲液组分等的影响。同时还会被蛋白质与SDS的浓度比例以及蛋白质中完整的二硫键数所左右。①当蛋白质与SDS单体浓

7、度比为1:4或1:3时，二者可充分结合；②在低离子强度（100nmol/L）时，SDS的平衡浓度较高，因而易与蛋白质结合；③蛋白质在还原剂存在时，才能被解聚，进而与SDS可充分结合；④蛋白质结合SDS的量，与其种类有关。上述情况表明，同一种蛋白质在不同条件下，结合SDS的量可能有差异，而不同SDS的含量，将会致使其产生不同的泳动度。因此，用SDS-PAGE测定蛋白质分子质量时，应在统一的条件下进行。）SDS的作用：消除氢键，消除蛋白质样品间分子形状差异；在添加还原剂还原二硫键后，与蛋白质定量结合，消除蛋白自带电荷的影响。SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

8、聚丙烯酰胺