濒危药用植物麻花秦艽和粗茎秦艽cpDNA提取研究.pdf

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1、2013第十五卷第九期*Vo1．15No．9濒危药用植物麻花秦艽和粗茎秦艽cpDNA提取研究六高欢欢一，倪梁红，胡志刚，姚辉。，吴和珍，潘宏林(1．湖北中医药大学药学院武汉430065；2．上海中医药大学中药学院上海201203；3．中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193)摘要：目的：对麻花秦艽和粗茎秦艽叶绿体基因组进行提取研究，为进一步研究秦艽叶绿体的基因组序列特征、遗传多样性以及资源保护研究奠定基础。方法：本文以麻花秦艽、粗茎秦艽为对象，采用改良的蔗糖密度梯度离心方法进行提取，优化纯化方法，分离得到秦艽叶绿体后测定cpDNA浓度，检测其OD值并扩增ITS2序列验

2、证其纯度。结果：获得高质量、高纯度的cpDNA(0．1～0．4~g／10g)，扩增ITS2序列验证其无核污染，满足后续测序要求。结论：cpDNA的纯度和质量对叶绿体基因组测序的正确率和可信度具有重要的影响。本文获得了高纯度、高质量的秦艽cpDNA，为秦艽叶绿体基因组全序列的获得提供保障。关键词：麻花秦艽粗茎秦艽叶绿体DNA提取doi：10．1l842／wst．2013．09．002中图分类号：R284．2文献标识码：A自1986年第一条完整叶绿体发表以来_l1，叶绿_6l。因此，cpDNA提取研究是进行叶绿体基因组研究体基因组的研究备受关注。叶绿体基因工程以及系的基础。统发育是其主要的

3、研究方向，并且被广泛用于叶绿秦艽是我国重要的传统中药材，始载于《神农体转化技术及植物亲缘关系鉴定的基础和应用研本草经》，“主寒热邪气，寒湿风痹，肢节痛、下水、利究【2~4J。截止2013年2月，NCBI数据库一公布了小便”。麻花秦艽(GentianastramineaMaxim．)和粗茎324条完整叶绿体序列，但多数为经济作物，已知的秦艽(GentianacrasicaulisDuthieexBurk．)是其来源药用植物叶绿体基因组相对较少。叶绿体DNA之一，由于生长周期长、数量少、过度采挖，致使秦(cpDNA)的提取困难和测序成本较高是制约获得药艽野生资源严重枯竭，被列为国家三级重点

4、保护植用植物叶绿体全基因组序列的两个重要因素。而以物。在前期的研究中，罗煜等【71筛选了可准确鉴别多标签技术对多个物种进行高通量测序时，对cpDNA基源秦艽药材和其常见混伪品的DNA条形码序的浓度和纯度要求严格，需保证无核基因组DNA列，张得钧等[1基于黄管秦艽叶绿体基因进行核苷和线粒体DNA污染L5j，尤其以三代测序平台PacBio酸变异和遗传分析，为黄管秦艽优良种质资源筛选测序时，高纯度的cpDNA模板获得数据准确率更高和规范化种植提供科学依据。目前尚无对秦艽叶绿体基因组的研究。通过对药用植物叶绿体基因组的研究，可以推动叶绿体转化技术、植物亲缘关系鉴收稿日期：2013-03一O1修

5、回日期：2013-03—19★科学技术部国家高技术研究发展计划(“863计划”)项目(2012AA021602)：基于DNA条形码的珍稀药用、野生等资源快速检测技术及产品研发，负责人：陈士林；教育部长江学者和创新团队发展计划(IRT1150)：中药资源学，负责人：陈士林。★★通讯作者：吴和珍，教授，博士，主要研究方向：中药的品种、质量及资源开发研究；潘宏林，教授，主要研究方向：中药资源及其品质研究。★★★http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／genomes／GenomesGroup．cgi?taxid=2759&opt=plastid1871[WorldScience

6、andTechnology~ModernizationofTraditionalChineseMedicineandMateriaMedica]世界科学技术一中医药现代化★思路与方法定及遗传多样性研究在保护濒危中药资源中的应1：10。为比较此步的作用，提取粗茎秦艽时按照等文用。因此，本文对获得高质量秦艽cpDNA的研究，献中方法加入400mL预冷的(4℃)BufferA，麻花是进一步挖掘秦艽叶绿体基因组遗传信息的前提，秦艽加800mLBufferA。另一方面，BufferA配方为秦艽资源保护研究奠定基础。中BSA和DTT在匀浆前加入，防止久置丧失其抗氧化作用，见图1。1材料与方法1．2

7、．2提取cpDNA1．1材料加入CTAB／NaC1溶解cpDNA细胞膜过程中，加1．1．1植物材料入5％PVP40，有效去除吸取叶绿体细胞器过程中带采自西藏地区的麻花秦艽和粗茎秦艽(表1)，人多糖的污染，同时去除DNA酚的污染见图1。经上海中医药大学生药学教研室赵志礼教授鉴定为正品。每种秦艽取新鲜叶片各80g，洗净保存在对叶片预处理干冰中运输至实验室。叶片剪碎后保存在缓冲液1L中，一80~C冻存。，、、1．1．2试剂与成分匀浆、实验所用试剂为B