PCR技术的原理和方法.doc

《PCR技术的原理和方法.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、PCR技术的原理和方法1.PCR定义PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板，以特定引物为延仲起点，通过变性、退火、延仲等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA休外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNAo可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。2.PCR技术的基本原理即在高温(95°C)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温(37〜55°C)情况下，两条人工合成的寡核苛酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链

2、；在Taq酚的最适温度(72°C)下，以引物3,端为合成的起点，以单核廿酸为原料，沿模板以5^39方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一-次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一•次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2"的批数形式迅速扩增，经过25〜30个循环后，理论上可使基因扩增IO®倍以上，实际上一般可达1()6〜心倍。模板变性迫火延伸变性退.火延仲循环2A4-L1棋扳

3、示意图假设扩增效率为“X”，循环数为“iT,则二者与扩增倍数丁啲关系式可衣示为：y=(l+X)no扩增30个循环UPn=30时，若X=l00%,则y=23O=1073741824(>109)；W若X=80%吋，则尸1.8叫45517159.601(f)。山此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经澳化乙锭染色，在紫外灶照射下(254nm)—般都可见到DNA的特异扩增区带。3.PCR反应基本步骤3.1变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程(94°C,30s)。3.2退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DN

4、A中互补区域结合成杂交分子(55°C,30s)o如下图所示引物13，—GAACTTT—5'5、GGATC1AGCGTATGCTTGAAA——3、3'CCTAGATCGCATACGAACTTT——5、模板DNA5'—GGATC1A—3'引物2PCR引物与模板结合示意图3.3延伸（extension）：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按亍-3,方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链（70〜72°C,30〜60s）。以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。1.PCR扩增的基本方法4」PC

5、R反应体系成份终浓度10XbufferMgchPrinier（2个）dNTPs（4利i）BSATaq酶模板DNA纯水1/10体积1.5~2.5mmol/L各0.2Pmol/L各200umol/L100ug/mL1〜2.5单位/反应体系102〜105个分子（lOOng）补至所需体积（25〜50口1）4.2PCR反应的成分和作用总体积：一-般为25U1〜100U1（1）无Mg2buffer：山纯水、kcl、Tris纟II成。Tris用于调肖反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。（2）Mg2+：终浓度为1.

6、5〜2.0mmol/L,其对应dNTP为200umol/L,注意与dNTPs之间的浓度关系，曲于dNTP与Taq酶竟争Mg2+,当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酚的活性。Mg"能影响反应的特异性和产率。（3）BSA：一般用乙酰化的BSA,起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。（4）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0〜7.5,—般存储浓度为10mmol/L,各成份以等当量配制，反应终浓度为20〜200umol/Lo浓度可加速反应，但同时増加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（5）Taq酶：

7、能耐95°C高温血不失活，其最适pH值为&3〜&5,最适温度为75〜80°C,一般用72aCo能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按方向逐个将dNTP分子连接到引物的3,端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3—5,的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高，会增加其错配率。用量一般为0.5〜5个单位/lOOu1（6）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反