芯片瞬间等速电泳-筛分电泳偶联分析精确计算DNA长度.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第1期2010年1月ChineseJournalofAnalyticalChemist~15～2O芯片瞬间等速电泳．筛分电泳偶联分析精确计算DNA长度刘大渔梁广铁莫建坤周小棉(广州医学院附属市一人民医院检验科临床化学技术研究室，广州510180)(广东省第二人民医院检验科，广州510317)摘要建立了基于相对迁移时间比例的方法，依据待侧DNA片段相对于上位及下位内标的迁移时问比例进行长度预测。实验结果显示，DNA片段的相对迁移时间比例在不同分析条件下具有良好的重现性。通过建立相对迁移时间比例相对于DNA片段长度的对应关系公式，

2、实现了芯片瞬间等速电泳条件下DNA片段长度的准确预测。实际样品分析证实这种基于相对迁移时间比例的计算方法简单可靠，适合于芯片tITP—CGE分析中DNA长度的精确判定。关键词芯片电泳；瞬间等速电泳；DNA长度计算；迁移时间；样品盐浓度1引言芯片电泳具有快速高效分析、低消耗和便于实现各种操作单元灵活组合及规模集成的特点¨’。上述特点和优势使得芯片电泳成为一种极具发展潜力的生物分析技术。DNA分析是芯片电泳最为成功的应用领域之一，多种类型DNA样品在芯片平台实现了高效分析。。芯片电泳由于采用微尺寸通道便于实现高效分离，但同时由于通道尺寸造成的进样量限制也影响了检测灵敏度。为改善芯

3、片电泳检测灵敏度，近期研究发展了多种在线预浓缩方法并取得显著效果。等速电泳是在芯片DNA分析中应用较为普遍的在线预浓缩技术，该技术可显著改善检测灵敏度而不损失分离效率。瞬间等速电泳(Transientisotachophoresis，tlTP)是一种简化的等速电泳预浓缩方式，利用样品基质(Samplematrix)中的离子为前导或尾随离子，将等速电泳预浓缩与后续的区带电泳分离偶联¨。在芯片上偶联瞬间等速电泳和筛分电泳(tITP．CGE)，可以简单有效地改善高盐DNA样品的检测灵敏度。DNA定性分析通常是通过比较待测样品与标准样品的迁移时间来确定DNA片段大小，因而不同样品迁移

4、时间的一致性对于长度判定的精确性具有重要影响。在tITP—CGE分析中，由于等速电泳持续时间受样品区带电导率影响，样品盐浓度影响瞬间等速电泳持续时间以及整体迁移时间¨。不同盐分样品之间的迁移时间差异不利于精确定性分析。针对这个问题，曾有研究报道通过引入内标校正tITP分析中由于样品盐分不同引起的迁移时间变异¨。本研究中，为了消除样品盐浓度对于DNA长度判定的影响，在芯片tlTP—CGEDNA分析中引入内标。待侧DNA片段相对于双内标的迁移时间比例，即相对迁移时间比例(Relativemigration-timeproportion，RMP)，用于DNA长度计算。研究结果显示，

5、本方法(以下简称RMP法)简单可靠，适合于芯片tITP—CGE分析中DNA长度的精确判定。2实验部分2．1仪器与试剂芯片电泳实验在自行研制的激光诱导荧光微流控芯片电泳分析仪¨上完成。该仪器由芯片电泳平台、光学检测系统、CCD监测、高压电源控制和操作软件组成，检测方式为共聚焦激光诱导荧光。仪器分析软件可以设定电泳分析各步骤中电极输出状态，显示电泳谱图以及迁移时间、峰高、峰面积和半峰宽等参数。咪唑、，v-(乙一羟乙基)哌嗪一Ⅳ一2乙烷磺酸(HEPES，Sigma公司)；羟丙甲基纤维素(HPMC，2％，粘度为40—60cp，Aldrich公司)；系列标准DNA片段，100bpDNA

6、ladder(100～600bp，Tiangen公司)；50bpDNAladder(50～1500bp，Takara公司)；插入式DNA标记染料GeneFinderTM(Biovision公司)。2009-07-26收稿；2009—10-06接受本文系“十一五”重大专项(No．2008ZX10004-004)、国家自然科学基金(No．30870753)和广东省科技计划项目(No．2008B060600036)资助Email：ruark@126．eom16分析化学第38卷2．2实验方法2．2．1芯片设计和制作玻璃基板(6．5cmx6．5em，长沙韶光铬版有限公司)表面涂有正光刻

7、胶。玻璃芯片采用标准光刻-湿法腐蚀一热封接方法加工而成¨。芯片通道为双T结构，有效样品区带长度7．5mm。芯片通道深度30m，通道半高宽50m。芯片电泳有效分离通道长度为4cm，参考文献[16]的方法对通道表面进行线性丙烯酰铵涂层以抑制电渗流和表面吸附。2．2．2芯片电泳芯片电泳实验中使用运行缓冲液含20mmolfLHEPES-40mmol／L咪唑、1×GeneFinder以及不同浓度的HPMC筛分介质；缓冲液pH=7．5。缓冲液使用双蒸水配制，使用前过滤。芯片在tITP—CGE分析中，缓冲液B首先加在