资源描述：
《原位杂交原理.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、实验一IEF/SDS—聚丙烯酰胺凝胶 双向电泳随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。自从澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出蛋白质组(Proteome)这一概念以来,国际上蛋白质组研究进展十分迅速,不论基础理论还是技术方法,都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立,相应的国际互联网站也层出不穷。1996年,澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心:Austra
2、liaProteomeAnalysisFacility(APAF)。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国,各大药厂和公司在巨大财力的支持下,也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。国内从1997年开始开展蛋白质组研究，已建立起基本蛋白质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究中心和军事医学科学院。目前年我国的蛋白质组研究进入了一个迅速发展的新阶段,其主要标志是国家科技部将蛋白质组研究确立为“973”和“863”的项目。蛋白质组学一经出现,就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”,即采用高通量的蛋
3、白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质,这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学,也更符合蛋白质组学的本质。但是,由于蛋白质表达随空间和时间不断变化,要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”,即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达,以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。一、实验原理聚丙烯酰胺双向电泳是一种由任意两个单向聚丙烯酰胺电泳组合而成的，在第一向电泳后再与第一向垂直的方向
4、上进行第二向电泳的分离方法。其基本原理是第一项基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦(Isoelectricfocusing)；第二项则根据分子量的不同大小进行ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分离,把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。经过电荷和质量两次分离后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。IEF/SDS-PAGE双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。采用IEF/SDS-PAGE分离蛋蛋白质，第一向IEF/SDS-PAGE所用的聚丙烯酰胺凝
5、胶通常为柱状，第二向SDS-PAGE所用的为板状。IEF/SDS-PAGE与IEF-PAGE和SDS-PAGE的区别在于：1.第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEF-PAGE时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向SDS-PAGE的进一步分离，必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP-40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内
6、的二硫键，促使蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS充分结合。2.第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向IEF-PAGE，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDS-PAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内
7、含-巯基乙醇和SDS等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向的电泳分离系统所取代。其中-巯基乙醇使蛋白质组分分子的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合，从而完成第二向SDS-PAGE的样品处理，即可进行第二向电泳。二.实验步骤蛋白质提取：称取0.2g花生胚脱脂粉，加入１ml样品裂解液，冰浴中充分研磨，4℃、12000g离心10min，上清液置-20℃下备用。１．试剂配制：第一向试剂：1）样品裂解液(内含9.5mol/L尿素、2%非离子型去污剂NP-40、0.8%AmpholinepH5
8、-7、0.8%AmpholinepH6-8、0.4%AmpholinepH3.5-10、2%二硫苏糖醇、5mmol/LK2CO3)：取5.7g新鲜尿素，2ml10%非离子型去污剂NP-40，0.2mlAmpholinepH5-7，0.2mlAmpholinepH6-8，0.1mlAmpholinepH3.5-10，0.2g二硫苏糖醇(DTT)，1ml50mm
