miRNA的提取与检测.ppt

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1、TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTDmiRNA提取与检测市场部赵丁主要内容什么是miRNA？miRNA的作用miRNA的研究路线miRNA的提取及检测4123miRNA的发现1993年，Ambros在线虫中克隆了lin-4基因，并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白，而是产生一种小RNA分子。这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3‘非翻译端的特定区域相互作用来抑制lin-14的表达,最终导致lin-14蛋白质合成的减少,这种现象叫做转译抑制。lin-4控制着线虫幼虫由L1期向L2期的转化。同时，Ruvkun也发现了lin-4对lin-14

2、的作用。TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell,1993miRNA的奠基者miRNA相关文献数量miRNA的相关文献什么是miRNA？miRNAs（MicroRNAs）是一种不编码蛋白质，大小约21-23nt的单链小分子RNA。它具有在翻译水平或转录后水平调控基因表达的功能。miRNA的合成过程基因组DNAPri-miRNA（可达1000nt）Pre-miRNA（70～100nt）成熟miRNADicer酶Drosha酶RNA诱导沉默复合

3、物调控基因表达Exportin5miRNA与靶mRNA的作用模式1）二者不完全互补。即二者不完全时配对结合时，主要影响翻译过程，而对mRNA的稳定性无任何影响。如线虫的lin-42）二者完全互补。即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性的切割mRNA。如miR-39/miR-1713）上述两种模式均具备。当其与靶mRNA完全互补配对时，直接靶向切割mRNA，而不完全互补配对时起调节基因翻译的作用。如let-7果蝇/线虫miRNA的特点结构特异性：茎环结构前体，无ORF高度保守性：结构和物种时空特异性：发育与分化表达统计：60%的miRNAs为独立表达15%的

4、miRNAs成簇表达25%的miRNAs位于内含子miRNA的作用miRNA的主要作用在胚胎发生，发育时序，器官分化，程序性细胞死亡和生长控制（癌症）。miRNA研究方法生物信息学构建miRNA文库miRNA芯片荧光定量PCRNothernblot原位杂交其它方法生物信息学生物信息学实验验证miRNA芯片的公司构建miRNA文库总RNA按片段大小分离（PAGE）-OH3’5’P-磷酸酶-OH3’5’HO-T4多核苷酸激酶T4RNA连接酶T4RNA连接酶逆转录，PCRBanI消化，再连接5’HO--P3’-P3’5’P-5’P--P3’-OH3’-P3’酶切位点-P3’酶切位点酶切

5、位点连接到载体并测序生物信息学实验验证提取miRNAmiRNA研究路线miRNA芯片选择样品miRNA文献检索转染沉默表达荧光定量PCR过量表达靶mRNA生物信息学抽提和吸上清沉淀RNAPAGE电泳裂解过柱洗脱miRNA的提取切胶回收裂解miRNA的提取后续实验反应酶活无法通过紫外来检测信息的完整性无法通过紫外和电泳来检测-20度或-70度冻存相对RNA来说，不易降解纯度得率保存miRNA提取后的检测对于少量血清/血浆提取，一般不建议进行紫外检测和电泳检测。对于低浓度的miRNA利用吸光值来确定miRNA浓度偏差较大，在有些时候仪器本身的误差即可造成测定结果的不准确。电泳的灵敏度

6、更低，在很多情况下凝胶上并不会出现条带。对于组织/细胞的提取，电泳时会出现明亮的条带，但条带中更多的是5SRNA和tRNA，紫外检测值无法准确的反映出miRNA的含量。盐分的残留天根DP501PEG分离DP501可以显著的降低盐分的残留（230nm）。反转录方法——茎环反转录方法——加尾荧光定量PCR灵敏度特异性内参基因5SrRNAU6ABCPg级总RNA单碱基差异TIANGEN公司miRNA产品线miRNA提取miRNA加尾后反转录miRNA荧光定量检测miRcutemiRNA提取分离试剂盒（DP501）样本：组织、细胞、血清、血浆等。采用不同的protocol，可提取miRN

7、A，也可提取总RNA。miRcutemiRNA第一链合成试剂盒（KR201）通过对miRNA进行Poly（A）加尾，在已知序列的引物下，进行反转录，获得miRNA的cDNA。miRcutemiRNAqPCR检测试剂盒（SYBRGREEN）（FP401）高特异性（专利的抗体酶技术）、高分辨率（单碱基差异）、高灵敏度（pg级的总RNA）。DP501对比实验利用DP501提取20余样品未发现堵柱现象DP501、KR201和FP401实验结果mir-12210倍倍比稀释的扩增曲线、融解曲