医学实验常用方法学简介.ppt

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1、以琼脂糖作为支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。特点：琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，从而提高了分辨能力。1.琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。琼脂糖凝胶电泳实验（1）用于DNA

2、切胶回收；（2）用于DNA分离；（3）用于佐证DNA是否重组、质粒等是否切开以及其他分子生物学研究。琼脂糖凝胶电泳的应用2.聚合酶链式反应（PCR）PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍.PCR由变性(加热至94℃)--退火(降至55℃)--延伸三个基本反应步骤构成.重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术可用于：（1）检验感染性疾病是否

3、处于隐性或亚临床状态；（2）有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；（3）临床应用于检测地中海贫血的基因突变。PCR的应用2.1实时荧光定量PCR（realtimePCR)实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。2.2逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。(1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；

4、（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。RT-PCR的应用WesternBlot是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。。3.WesternBlot应用（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。WesternBlot的应用