植物基因工程知识点.docx

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1、基因工程知识点1、植物基因克隆：通过一定的分子生物学手段，将植物基因组中编码基因的DNA分子或cDNA分子分离出来，在此基础上进一步对其基因的结构与表达、编码蛋白质定位以及生理生化功能等诸多方面进行研究，获得有关基因的全面信息。2、基因克隆涉及核酸分子的切割、连接、扩增和转移，因而涉及切割酶类、连接酶类、扩增酶类以及核苷酸的保护酶类；载体包括质粒、噬菌体以及人工构建的染色体载体等。3、载体的要求：a、具有外源基因插入的多克隆位点b、具有ori，可以砸宿主细胞中进行自主复制c、具有可以进行阳性克隆鉴定或者重组子筛选的标记基因，像如抗性基因d、

2、载体本身对宿主细胞不具毒性，同时对环境不存在显著影响4、入噬菌体：48kb,线状DNA分子，染色体基因有四种，头部合成基因，尾部合成基因，与本身整合、重组的个功能相关的基因，表达调控的基因，其他合成基因；在作为载体时，人为去掉20kb的非功能区，可以承受的外源基因片段为8-23kb；两侧具有粘性末端成为cos位点，可以形成环状分子；野生型噬菌体含有多个限制性内切酶位点，作为载体时，需要引入可供筛选的标记基因，常用的IPTG和X-Gal存在情况下，Lac基因通过α互补确定重组的噬菌体个体，此外，载体连接是具有一定的方向性，最后环化成环状分子，

3、注意限制性内切酶的位点专一性。5、Cosmid载体：结合了入噬菌体的cos位点与大肠杆菌中的可复制质粒，可以大量扩增繁殖6、Cosmid载体与入噬菌体和质粒载体的比较：①具有cos位点，进行相互连接后可以像噬菌体一样高效转导大肠杆菌，进入大肠杆菌宿主细胞后，可以实现自身环化②不具有入噬菌体上所有的基因，因此不具有溶源与溶菌周期，不能产生子代噬菌体颗粒，可通过添加头尾蛋白完成自身包装③具有自身复制原点ori与抗生素标记基因，侵染后可以与像质粒一样在大肠杆菌中繁殖④本身较小，小于10kb，可以插入较大的外源基因片段，入噬菌体的最大承载外源片段为

4、105%*48kb-Cosmid载体的长度，由此Cosmid载体可以克隆的外源基因片段为15-45kb，常用于基因组文库的构建，而噬菌体则用于cDNA文库的构建7、噬菌粒载体：作为载体时具有抗生素基因、质粒的复制起点8、噬菌粒载体与Cosmid载体相比的不同之处：①噬菌粒载体的分子量更小，小于质粒的3kb②复制方式不同，Cosmid载体通过Ter体系识别cos位点，将外源基因片段和载体包装到噬菌体中，噬菌粒载体在大肠杆菌内按照滚环复制的方式进行复制，当有辅助噬菌体存在时，噬菌粒载体复制方式发生改变，进行自身的滚环复制，包装成噬菌体颗粒后分泌

5、出大肠杆菌③噬菌粒载体与质粒载体十分相似，因此可以其所携带的外源基因片段可以通过质粒载体进行DNA提取后测序，噬菌体载体和Cosmid载体载体则必须进行亚克隆后才可以测定序列9、酵母人工染色体载体：（YAC）：以PBR322为基础，人工加入了酵母的着丝粒、自主复制原件与类似端粒结构的简单重复序列后，构建而成，长度约10.7kb，环状质粒。其优点是可以插入较大的外源基因片段，长达2000kb。与此同时也存在诸多隐患，像如，嵌和现象（在同一YAC克隆中，嵌合两个不连续的大片段，来自不同染色体或同一染色体的不连续区域，很不适合测序和作图；稳定性差

6、，存在序列重排和插入丢失现象；插入DNA分离纯化难；转化率低等10、细菌人工染色体载体（BAC）：以大肠杆菌的复制原件为基础构建的一种载体，类似于质粒载体11、RACE技术：详见分子生物学课本，关键词：5、3端引物，GSP，巢式PCR12、基因克隆方法：以已知序列为基础的克隆（氨基酸序列、同源序列与RACE-PCR）；以分子标记连锁图为基础的克隆；以人工突变体为基础的克隆(T-DNA标签法、增强子或外显子陷阱的方法；以表达差异为基础的克隆；以生物大分子互作为基础的克隆（酵母双杂交体系、噬菌体展示技术）13、酵母双杂交体系：（1）原理：真核细

7、胞的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域（bindingdomainBD）与转录激活结构域（transcriptionactvatitionAD）共同完成的。他们通过共价或非共价的连接建立空间联系是导致蛋白质之间相互结合与转录激活的关键。假定两个蛋白质分子X、Y之间存在相互作用，便可利用酵母双杂交系统将XY分别与酵母转录因子的两个结构域相互融合形成融合蛋白质，也就是BD-X/AD-Y或是BD-Y/AD-X，当两个结构域单独存在时不具有转录活性，只有当二者共存相互靠近或者共价结合时转录作用才被激活，报告基因表达活性。与BD结合的称为

8、诱饵蛋白，与AD结合的称为被诱捕蛋白，含有X、Y的蛋白质同时在一个酵母菌中表达，当两者相互作用时，诱饵蛋白与被诱捕蛋白相互靠近共价结合促进转录激活，进而使得报告基因表达。报告基因