超分辨光学显微镜的生物学应用.pdf

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1、第36卷第6期核技术、，o1．36．No．62013年6月NUCLEARTECHNIQUESJune2013超分辨光学显微镜的生物学应用毛秀海杜建聪黄庆樊春海邓素辉(中国科学院上海应用物理研究所嘉定园区上海201800)摘要生物学家一直渴望使用无损、可实时成像的远场光学显微镜对细胞内动力学行为或者纳米尺度的蛋白质一蛋白质相互作用进行研究。由于光学衍射极限的存在，传统的远场光学显微镜无法对200纳米尺度内的这些生命活动进行观察。近年来，克服光学衍射极限的超分辨成像技术快速发展，将分辨率提高至数十纳米级别。基于超分辨技术

2、的荧光显微镜包括受激发射损耗显微镜(STED)、光敏定位显微镜(PALM1以及随机光重建显微镜(STORM)。这些技术日趋成熟并成功应用于细胞生物学、微生物学、神经生物学等研究，为整个生命科学的发展带来全新的认识。关键词光学显微镜，超分辨，生物学，纳米，蛋白质中图分类号TL99生物学研究往往需要在活细胞条件下观察胞内STED)。同时，STED也是第一个用来突破衍射极组织的活动。光学技术因其具备对生物样品扰动最限的远场光学显微技术，其原理是采用两束组合激小、实时可见的优势，从而成为生物学观察的重要光，一束激光被聚焦成正

3、常的衍射极限焦斑，使焦技术手段lJ。远场光学显微镜一直促进着人类对微斑内的荧光分子处于激发态；另一束为中心光强为观世界的理解，并伴随着整个生物学领域的产生和零环形焦斑分布的损耗光，两束光进行叠加，损耗发展。三百多年以前，Hook等J对成像原理进行深光通过受激发射过程损耗周边区域内的激发态荧光入研究，发明了最早的光学显微镜。利用他发明并分子。因此，周边区域内的荧光分子被淬灭，只剩制作的光学显微镜首次观察到细菌以及微生物，开下中心的荧光发光点，从而实现小于衍射极限的荧创了生物学领域的新研究。常规的光学显微镜的横光发射面积

4、。从原理上讲，由于损耗光的中心光强向分辨率约200nm，纵向分辨率400—700nm，因为零，只要淬灭光足够强，则由第一束光激发的荧此，无法观测纳米大小的许多重要的生命体，如病光分子所占的体积可以被压缩到极小的范围内，极毒和细胞，以及生物体内的蛋白质等都无法进行观大提高荧光显微镜的分辨率。目前，STED显微镜测。为了揭示细胞内蛋白质活动和细胞微结构特征，可实现20nm分辨率的免疫荧光成像和50-70nlTl提高光学显微镜分辨率成为细胞生物学发展的迫切的荧光蛋白成像¨J。要求。第二类超分辨技术是基于单分子定位的成像方法

5、，利用光开关荧光蛋白，光敏化或光漂白现象将1超分辨成像的重要技术进展衍射极限范围内的单个分子在不同的时间随机地激活，并将各个荧光分子精确定位再重组，叠加获得近20年来，克服光学衍射极限的超分辨显微镜超分辨图像。该类技术通过将相互位置过于靠近而不断发展，基于荧光的显微镜技术利用分子的荧光无法被传统光学显微镜同时分辨的荧光标记分子逐能级跃迁特性、荧光灵敏度高和特异性好的特点，个予以分别激发，使各个荧光分子所成的艾里斑像将显微镜分辨率提高至纳米尺度。超分辨技术的基之间不再相互干扰，从而能够对每个独立的荧光分本原则是减少或避

6、免处在激发体积内的分子同时发子逐个进行定位。这样就可以通过提高时间分辨率，射荧光。目前，超分辨显微成像可以分为两种方法。来达到改善空间分辨率的目的。这一类技术的典型第一类是结合光学非线性效应对成像的照明光路进代表有光敏定位显微镜(Photoactivationlocalization行整形，获得小于衍射极限的荧光发光点。这类技microscopy,PALM)~I]随机光重建显微镜(Stochastic术的典型代表是Hell等c5]提出的受激发射损耗显微opticalreconstructionmicroscopy,S

7、TORM)等。镜(Stimulatedemissionofdepletionmicroscopy，第一作者：毛秀海，男，1986年出生，2008年毕业于华中科技大学，现为上海应用物理研究所博士研究生，从事纳米科学的研究讯作者：邓素辉，E—mail：dengsuhui@sinapac．cn收稿日期：2013．04—03，修回日期：2013·04-20060502—1核技术2013，36(6)：0605022006年，Betzig等【』驯首次使用光敏绿色荧光蛋结合的。但Neumann等[J佣双色STED荧光显微方白作为探

8、针标记样品，利用该光敏绿色荧光蛋白只法观察线粒体的结构，他们发现大部分的hVDAC有在405nm的激光敏化后，才能被561nm激发发并没有与在线粒体上的己糖激酶．1相结合。这些研射绿色荧光。他们首先利用低能量的405nm激光究充分展示了超分辨技术可以突破生物领域的瓶辐照，仅敏化极稀少的光敏蛋白，再使用561nm颈，有助于进一步认识细胞各蛋白的结