引物设计原则(最全汇总).doc

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1、引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）： 1. 普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性； 2. 下载基因序列到Vector NTI； 3. 找到所需安装载体序列； 4. 将基因序列的CDS高亮标记； 5. 寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。酶切位点一般是6bp的回文序列； 6. 从基因ATG开始往

2、后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp补齐序列），但最好保证最后两个是G或者C，以减少错配率； 7. 将上游酶切位点序列补在ATG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终止密码子； 8. 检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3’端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码； 9. 从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两

3、个是G或者C，以减少错配率； 10. 选择complementary sequence，在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 11. 将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3’端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码； 12. 最后在

4、NCBI的primer Blast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。                                              2011年10月18日                                                        左洁1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则

5、容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物所对应模板位置序列

6、的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。6.ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降

7、低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。③引物长度一般

8、在15~30碱基之间。④G+C含量在40%~60%之间。⑤碱基要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。⑧引物5′端可以修饰。⑨引物3′端不可修饰。⑩引物3′端要避开密码子的第3位。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区