漆斑菌Myrotheciumsp.IMER1液体和固体发酵产胆红素氧化酶分析.pdf

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1、2015年第9期ScienceendTechnology&Innovationl科技与创新文章编号：2095—6835(2015)09—0005—03和固体发酵产胆红素氧化酶分析★刘友勋，闰明阳，黄娟，赵春澎(1．新乡医学院基础医学院，河南新乡435003；2．华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074)摘要：为了提高漆斑茵Myrotheciumsp．IMER1的胆红素氧化酶(bilirubinoxidase，BOX)产量，分析了其液体和固体发酵产酶的特性。首先分析了该茵株液体和固体发酵产BOX的时间变化曲线，对其所产的胞外酶进行了

2、活性电泳，进一步分析了其液体产酶的模型和宏观动力学内容。结果表明，菌株IMER1在液体发酵中第5天的产BOX酶量最大，其固体发酵产酶量最大时间也是在第5天，但是，其固体发酵能持续高产BOX。从BOX的底物活性显色中可知，在固体和液体发酵的粗酶液中都能检测到BOX，并且没有同工酶出现；而BOX生物合成模式为中期合成型，通过数据计算和模拟得出了产酶动力学方程。关键词：胆红素氧化酶；漆宛茵；液体发酵；固体发酵中图分类号：TQ925文献标识码：ADOI：10．159138．cnki．kjycx．2015．09．005胆红素是一类线形四吡咯衍生物。在人

3、体内，如果不能及马铃薯液体培养基(PDB)：马铃薯2O％(削片煮水)，质量分时去除由于血红素降解而产生的胆红素，那么，过多的胆红素数为2％的葡萄糖；固体培养基：麸皮5g，水15mL不仅会使皮肤变黄，产生黄疽，而且还具有明显的神经毒性，UNICO。UV-2000型紫外可见分光光度仪(上海尤尼柯仪器会导致耳聋、精神迟钝和大脑麻瘅，严重时还会致死。胆红素有限公司)；TGL．16／TGL16台式高速冷冻离心机(湖南湘仪集氧化酶(bilirubinoxidase，BOX，EC．1_3．3．5)是一种含铜的多团)；ZD．88全温气浴振荡摇床(金坛市成辉仪

4、器厂)。酚氧化酶。它能催化胆红素氧化，而且氧气是其电子受体，具1．2实验方法体的反应过程为BOX催化胆红素生成胆绿素，后者可进一步氧1．2．1液体培养化，最终生成性质还不清楚的无色化合物。最早，BOX是在荷通常情况下，IMER1菌株的PDA斜面种5—7d便可产生兰猪脑中被发现的，随后又发现了多种真菌，比如食用双孢蘑大量的分生孢子，用适量的蒸馏水将试管中的孢子冲洗出来，菇、青霉属和漆斑菌属也能分泌该酶。但是，自从日本学者发利用显微计数，将孢子数量调整到1×100／mL，用前将孢子悬现漆斑菌属能高产BOX后，在临床医学中，开始尝试使用该酶浮液摇匀

5、。用移液枪吸取1mL孢子液注射入灭菌后100mL的来测定胆红素。这种方法具有特异性、灵敏高和操作简便等优液体培养基中，将接种的培养基放在摇床中，在150rpm下振点，适用于临床手工或自动化检测中。近年来，BOX的应用领荡培养。菌株IMER1在液体基质中培养一段时间后，将菌丝过域逐渐拓宽，被用于生物电池的制造、污水处理等研究中。最滤即可得粗酶液。近也有文献报道指出，芽孢杆菌的孢子外壳蛋白也具有BOX活1．2．2固体培养性，但是，细菌的BOX氧化能力比真菌的氧化能力要低，所以，用移液枪吸取上述配制好的1mL孢子液，将其注射人灭菌工业生产BOX还是

6、以漆斑菌发酵产酶为主。鉴于BOX应用范后的固体培养基中，然后放入恒温培养箱中培养(27℃)。菌围的日益广泛，对其酶的需求量也在逐年提高，而如何改善漆株IMER1在固体培养基中培养一段时间后，加入50mL的蒸馏斑茵发酵产BOX的能力，是目前面临的一大难题。在前期实验水，然后振荡3h，再过滤收集粗酶液。中，筛选到了一株能产生BOX的漆斑菌(Myrothecium1．2．3酶活测定sp．IMER1)，本文拟通过分析其液体和固体发酵产酶的相关特ABTS法参见参考文献。在3mL反应体系中，含有2．7mL性，为提高菌株IMER1产BOX的能力打下坚实的基

7、础。pH为4．5、物质的量浓度为0．2mol／L的乙酸．乙酸钠缓冲液，1材料与方法0．1mL的酶液，物质的量浓度为1mol／L的ABTS0．2mL，按1．1材料和主要仪器次序混合并摇匀，30S后开始记录～20，每隔15S记1个20供试菌株IMER1(Myrotheciumsp．IMER1)；2，2-连氮．值。1个酶活力单位(U)在上述条件下，每分钟催化l／~molABTS双．(3．乙基苯并噻唑．6．磺酸)铵(ABTS，美国SIGMA公司)；氧化所需的酶量。★[基金项目]国家自然科学基金(编号：U1304302)；河南省教育厅科学技术研究重点项

8、目(编号：12B180030)WaterHyacinthEutrophicWaterPurificationEffectOfInfluentialFactorsRe