疟原虫检验技术.ppt

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1、疟原虫检验技术-血片制作、染色及疟原虫形态鉴别贵州省疾控中心地病所卢丽丹寄生人体的四种疟原虫间日疟原虫[P.vivax，P.v]恶性疟原虫[P．Falciparum,P.f]三日疟原虫[P．Malariae,P.m]卵形疟原虫[P．Ovale,P.o]我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；另二种少见，近年偶见国外输入病例。其它疟原虫诺氏疟原虫(Plasmodiumnowlesi)内容提纲血片制作与染色疟原虫计数疟原虫的基本形态特征血片制作第一步：载玻片的清洗用加有洗洁精或洗衣粉的热水洗涤，清水冲洗后凉干，浸于

2、95%的乙醇中1小时以上用绸布擦干置干燥环境中保存。第二步：患都信息的核实采集血样涂片时，首先要核对患者的姓名和年龄并在玻片的右侧编号第三步：采集血样采血部位：耳垂或无名指，取血方法：通常在耳垂取血，先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指紧捏耳垂上方或无名指指尖，右手持消毒针迅速刺入皮肤，不宜过深或过浅。然后用右手中指轻轻挤压出血。厚血膜血量约一粒米大小,薄血膜血量为厚血膜的一半或1/3。厚血膜用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片接触，再

3、由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适当远的地方.将推片的边缘紧贴载玻片，轻轻上下移动，使血液沿边缘散开，然后匀速地向前推进，形成薄而平铺的薄血膜第四步：血片制作厚血膜薄血膜制片过程图示标签标准的疟疾厚薄血膜片标签●厚血膜血量不宜过多或过少●薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列血片的制作×××××√血片制作影响因素载玻片必须清洁无油污，理想的薄血膜是一层血细胞均匀分布不重叠、无裂缝、无皱折和空泡，血膜末端呈舌状；厚

4、血膜厚度以一个油镜视野内可见5-10个白细胞为宜；血片制作场所要保持清洁，以免尘埃沾污血膜，防止苍蝇等舔食血膜；制成的血片在未干前不能倾斜放置，待其自然干燥，不要加热，加热会使原虫变形，影响镜检结果．血片染色两种染色方法:●吉氏染色法1.染色原液配制2.门诊快染、慢染3.成批染色和溶血染色●瑞氏染色法WHO推荐使用吉氏染色法吉氏染液(原液)的配置吉氏染粉(AzureBtype)5g甘油(纯)250ml甲醇(纯)250ml●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨,然后边加边磨，直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕

5、色瓶中，在研钵中加入少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存时间越长染色效果越好。●整个染色液配制时间不能少于5个小时血片染色第一步：薄血膜的固定厚血膜充分干燥,用甲醇固定薄血膜，平放待干（要点：甲醇不能触碰到厚血膜）血片的染色第二步：染色用水和冲洗用水配制常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水用pH7.0～pH7.2的缓冲液。操作1（快染）量筒内量2ml缓冲液(PBSPH7.0)或净水，直

6、接滴加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血膜上，染色10min，清水缓缓冲洗，晾干（血膜朝内面）镜检。操作2(慢染)量筒内量2ml缓冲液或净水，再滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染色30min。清水缓缓冲洗，晾干镜检。第三步：血片染色将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染液（3毫升吉氏染色液加缓冲液或净水97毫升，混匀）浸没血片，染色30分钟。（如染液稀释液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将染色片插于晾干板上晾干，包装，待镜检。成批血片染色厚血膜溶

7、血染色放置多时未染色的血片（3天以上，薄片已用甲醇固定），染色之前，须在厚血膜上用清水进行溶血，待血膜全部溶解后用3%-5%吉氏染色液染色30分钟。然后用清水漂洗干净,晾干。质量好的染色显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色，薄血膜平整，红细胞单层排列如果血片偏红,说明染液偏酸性如果血片偏蓝,说明染液偏硷性外观吉氏染色血片偏酸偏碱标准配置完吉氏原液时必须过滤除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量；染液稀释后使用时间：原液必须临用时稀释，随配随用；染液的稀释浓度；染色时间。染色质量影响因素用水过酸，可致感染的RBC上的点彩

8、染不出来；用水过碱，则使薄血膜上的RBC染成灰蓝色，致使R的胞浆难以辨论。染色稀释用水:PH7.0-7.2清洁水。染色质量影响因素固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜；血膜在制备后应尽量能在当天染色，一般夏天不超过48小时，冬天也不能超过72小时,放置时间越久，厚血膜越不易脱血，染色效果也差。染色质量影响因素疟原虫镜检●疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点●疟原虫密度计数方法●人体四种疟原虫的形态特征●当前分子生物学、血清学技术快速发展,