实验十 pC57 T载体的制备.doc

《实验十 pC57 T载体的制备.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、实验十pUC57T载体的制备一．原理PCR产物的克隆是一种有效的克隆目的基因的方法，但是在实际应用中，由于方法学上的一些技术问题可能限制其应用。由于PCR产物3`末端突出一个A，因此克隆PCR产物的载体3`末端必须突出一个T，这样载体与PCR产物之间形成粘性长端。现在许多公司开发出了此类专用于PCR产物克隆的T载体。本实验中将平端内切酶EcoRv酶解的EcoRv，用Taq酶将其3`末端加上T，然后用T4连接酶将能自身环化的质粒连接。用凝胶电泳将自身环化的质粒与3`末端带有T．不能自身环化的线性质粒分开，回收线性质粒片段即为pUC57T载体。二

2、．方法1．制备pUC57质粒DNA。(见实验一)2．用EcoRV酶解pUC57DNA。(见实验九)3．在酶解的pUC57DNA末端加上T。取一支0.5ml微离心管．加入：EcoRV酶解的pUC57DNA10μg10XPCR缓冲液15μldTTP10mmol／L20μlTaqDNA聚合酶(5U/μl)1μlddH2Oto150μl10000r/min离心5s混匀，72℃水浴2h。4.DNA片段的纯化(1)在上述0.5ml微离心管中加入等体积(15μl)酚／氯仿混匀，放置数分钟，5000r/min离心5min．使液体分层。(2)吸收酚／氯仿抽捉提

3、之水相至另一1.5ml离心管中，加入1/10体积的乙酸钠，加2倍体积冷无水乙醇，混匀。-20℃冰箱放置2h，15000r／min离心15min。(3)倾去乙醇，加入70％冷乙醇淋洗。(4)倾去乙醇，滤纸吸干，真空抽吸2～3min。(5)加人30μlddH2O，溶解DNA。5．载体DNA自身连接在DNA片段纯化管中，加入5μl10x连接酶缓冲液和2UT4DNA连接酶，并用重蒸水补至总体积50μl。16℃连接16小时。6．琼脂糖凝胶电泳将DNA连接液在l％(Wt／V01)琼脂糖凝胶上电泳分离pUC57T载体和原载体7．pUC57T载体的纯化用琼脂

4、糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性载体，井用电泳对此载体进行定量。1．10mmol／LdTTP。2．TaqDNA聚合酶，5U/μl3．酚／氯仿。4.乙醇．放置-20℃冰箱保存备用。5．乙酸钠，6．70％冷乙醇7．ddH2O。8．琼脂糖。9．T4DNA连接酶。10．10X连接酶缓冲液。11．溴酚蓝指示剂12．EB溶液13．琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒四．说明本实验是一个典型的将具有平齐末端的线性DNA片段变成粘性片段的方法。在基因工程过程中．经常要将平齐末端转变为粘性末端或要将粘性末端转变为平齐末端，除了本实验中的方法外．还有下列方法：1．在平齐末端

5、产生新限制性内切酶位点的方法(1)试剂①T4DNA连接酶②10xT4DNA连接酶反应缓冲液300mmol／LTris-HCI，pH7.8100mmol／LMgCl2100mmol／LDTT10mmol／LATP注：l0X连接酶缓冲液应-20℃保存。不要多次冻存和融化。连接缓冲液中ATP降解连接反应失败的最常见原因。③磷酸化限制酶接头④无核酸酶重蒸水⑤限制性内切酶及其缓冲液⑥氯仿：异戊醇(24：1)TE缓冲液10mmol／LTris—HCIlmmol／LEDTA酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合等体积的TE缓冲液与重蒸酚，分层后，再将1份下

6、层酚相与1份氯仿：异戊醇(24：1)混合即可。(2)原理限制酶接头是合成的DNA双链，含有限制性内切酶识别序列，可用于将一个新的限制性内切酶位点加入到含平端的DNA片段上。商品化的接头有5`末端磷酸化和非磷酸化两种。磷酸化的接头更适于本实验．因为T4DNA连接酶需要一个DNA模板5`末端含磷酸基团。使用磷酸化的接头可以与非磷酸化的载体连接，这样可以降低载体自身重新连接的背景。(3)方法①取一微离心管，分别加入：10XT4DNA连接酶反应缓冲液1μlDNA(100—500ng)1μl磷酸化限制酶接头超过DNA片段的摩尔数100倍·T4DNA连接

7、酶(Weiss单位)2.5u加无核酸酶蒸馏水至l0μl*注：1μglkbDNA片段约为1．52pmol．商品限制酶接头常以A260度量对于10碱基的限制酶接头，0.015A260的量相当于大约152pmolDNA。②15℃反应6～18小时。③70℃加热10分钟终止反应。④立即在冰上冷却反应管，用相应的限制性内切酶进行酶解，⑤酶解后，加等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)到反应管中提取DNA，振摇l分钟，12000g离心5分钟。⑥转移上层水相至另一新离心管中．为增加回收率，有机相用小量TE缓冲液重提一次。⑦加等体积氯仿；异戊醇(2J1：1)

8、，振摇30秒，12000g离心2min，移上层水相至另新管中。⑧用琼脂糖凝胶电泳除掉未连接的限制酶接头片段，从胶中川收DNA片段。2．将5’突出末端转变为平端的方法