口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究.pdf

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1、动物医学进展，2012，33(3)：14—18ProgressinVeterinaryMedicine口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究吕建强，杨俊兴，花群义，曹琛福。，张彩虹，陶虹。，刘建利，阮周曦(1．深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳518045；2．深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室，广东深圳518045)摘要：利用单克隆抗体技术制备抗口蹄疫病毒的单克隆抗体，特异性试验表明其只与O、A、Asia1型3种血清型FMDV抗原结合。进而采用胶体金标记技术，以胶体金标记的抗口蹄疫病毒单克隆抗体、多克隆血清抗体和葡萄球菌A蛋白为

2、主要材料，研制口蹄疫快速检测试纸条。该试纸条检测O、A、Asia1型3种血清型灭活口蹄疫病毒均为阳性，检测水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒、蓝舌病病毒、猪蓝耳病病毒4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒疫苗株均为阴性，试验结果与口蹄疫实时荧光定量RT—PCR方法的完全一致，表明其具有良好的特异性。敏感性试验结果是，试纸条的检测极限为1：16O稀释的样品，其敏感性相当于实时荧光定量RT—PCR方法的l／64。由于试纸条具有操作方便、检测快速等优点，因此该试纸条可以用于大量临床样品的快速检测和现场检测。关键词：口蹄疫病毒；单克隆抗体；胶体金试纸条中图分类号：$852

3、．659．6文献标识码：A文章编号：1007—5038(2012)03—0014—05口蹄疫(Footandmouthdisease，FMD)是由口灭活抗原及相应豚鼠血清抗体均购白兰州兽医研究蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV))所；水疱性口炎病毒(VSV)、猪水疱病病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性和快速远距(SVDV)、蓝舌病病毒(BTV)、猪蓝耳病病毒离传播的动物疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列(PRRSV)4种灭活抗原及小反刍兽疫病毒(PPRV)为必须报告的传染病。国内外在口蹄疫血清学检测疫苗株由

4、深圳出入境检验检疫局动检实验室保存。方法方面做了广泛深入的研究，但是在抗原检测方1．1．2主要试剂(盒)及耗材氯金酸、SPA为Sig—法的研究方面略显不足。快速、方便、灵敏、简单的ma公司产品；背衬、硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫病原诊断方法对口蹄疫疫情监测和预警起着至关重和金标垫均为Millipore公司产品；单抗亚型鉴定试要的作用，而传统的诊断方法如乳鼠中和试验、补体剂盒(MouseMcAbisotypingtestkit)为HyCult结合试验等都有成本高、耗时及需要生物安全防护biotechnology公司产品；蛋白A／G单克隆抗体纯化等缺点

5、，且不利于基层工作者应用，因此研制快速、试剂盒为Thermoscientific公司产品。直观、准确的检测方法是口蹄疫疫情防控的关键。1．1．3实验动物8周龄～l2周龄Balb／c小鼠购胶体金标记的免疫层析技术，具有简单、快速、直观自中山大学动物医学实验中心。和不需要特殊仪器以及无需增殖病原的特点，适用1．2方法于基层兽医站、养殖场和疫病的大面积普查及口岸1．2．1口蹄疫单克隆抗体的制备及纯化现场检测等方面]。本文研制了一种特异、简便、1．2．1．1动物免疫用O型FMDV灭活抗原免疫快速、直观的FMD胶体金快速检测试纸条，其可以Balb／c小鼠5只

6、，每隔2周免疫1次，共免疫3次，分别检测O、A、Asia1型口蹄疫病毒抗原，为有效注射剂量分别为100、100、200#g／只。首免时抗原监控口蹄疫疫情提供了有力的工具。中加等体积弗氏完全佐剂乳化，二免和三免时加等l材料与方法体积弗氏不完全佐剂乳化(。]。三免后15d，断尾采1．1材料血分离血清，用间接ELISA检测血清抗体效价，用1．1．1病毒抗原及血清O、A、Asia1型FMDVSPF小鼠血清作为阴性对照血清。选取ELIsA血收稿日期：2011-lO20基金项目：中华人民共和国质量监督检验检疫总局科研项目(2。09IK()O1)作者简介：吕建强

7、(1975一)，男，内蒙古临河人，高级兽医师，博士，主要从事动物病毒学及疫病检测方法研究。*通讯作者吕建强等：口蹄疫病毒抗原胶体金试纸条的研究15清抗体效价高的小鼠，通过尾静脉注射FMDV灭活1．2．3胶体金标记单克隆抗体的制备采用柠檬抗原强化免疫1次，剂量为100Fg／只，3d后即可用酸三钠还原法制备胶体金溶液。向99mL三蒸水于分离脾细胞，进行与SP2／O细胞的融合。中加入1mL浓度为10g／L的氯金酸溶液，加热至1．2．1．2分泌抗FMDV单克隆抗体杂交瘤细胞株沸腾，迅速加入2．4mL1O．5g／L柠檬酸三钠溶液，的建立将免疫鼠脾细胞和SP2

8、／O骨髓瘤细胞进行充分混匀，继续加热约5rain10min，溶液由蓝色融合，加入适量的含HAT的选择性培养基进行培变为红色