脐带间充质干细胞制备操作规程.doc

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1、1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。静置培养7天。第8天根据生长情况，进行换液、传代。2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。3.传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2％FBS+a-MEM）10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10

2、ml生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。1200rpm，离心6min，弃上清。合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2×104/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养。4.收获：每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16m

3、l生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。弃上清，离心沉淀用2.5mlFBS悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。冻存细胞数应控制在2~5×106/ml范围内。利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。