猪弓形虫病的诊疗报告.doc

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1、猪弓形虫病的诊疗报告　　摘要：对一例病猪进行了流行病学调查和实验室检查，结合血清学和聚合酶链式反应方法进行病例检测，结果表明，该例病猪是由弓形虫感染引起。　　关键词：猪；弓形虫病；聚合酶链式反应；诊断　　中图分类号：Ｓ８５８．２８；Ｓ８５１．３１＋３；Ｓ８５２．７２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11404－0796-04　　　　ClinicReportforDiagnosesofSwineToxoplasmosis　　　　ＬＩＵＴａｏ，ＷＡＮＧＲｕｉ，ＱＵＺｈｅ－ｈｕｉ，ＷＥＩＡｉ－ｚｈｉ，ＺＨＡＮＧＬｉｎｇ　　　

2、　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｎｄｌａｂｏｒａｔｏｒｙｔｅｓｔｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｏｎｏｎｅｃａｓｅｏｆｐｉｇｄｉｓｅａｓｅ．ＣｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｓｅｒｏｌｏｇｙａｎｄＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｄｉｓｅａｓｅwasｃａｕｓｅｄｂｙＳｗｉｎｅＴｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｗｉｎｅ；tｏｘｏｐｌａｓｍosis；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　　　　弓形体

3、又叫弓形虫、弓浆虫或毒浆虫，属于一种单细胞原虫，是引发弓形虫病的病原体。病原体寄生在终末宿主猫科动物体内生长繁殖，形成卵囊并随宿主粪便排出体外，发育成熟而具有感染力。具有感染力的卵囊污染食物和水源，被中间宿主食入或饮入后，经淋巴和血液进入组织器官，并侵入有核细胞内，造成组织器官的严重损害和机体免疫力下降，而出现患病体征。据相关统计资料表明，一般猪场猪群感染率在２０％以上，有的高达６０％，死亡率达６０％～８０％。弓形虫病一年四季均可发生，但以每年的４～１０月多发，任何年龄的猪都可感染，而以１０～５０ｋｇ的中小猪发病较严重。

4、临床上生产母猪常有发病，但配种公猪很少发生，这可能与抵抗力有关［1-3］。高床饲养的猪群少见发病，而平养的猪群则屡见不鲜，可能与猪只接触粪便的程度有关。河南省信阳市平桥区某商品猪场养猪３０００多头，２０１０年４～５月期间猪群突然发病，在１个月内陆续死亡５头，２０多头病危，另有１００多头发病。发病和死亡的猪以４０～５０ｋｇ的中小猪为主。作者主要就这起猪弓形虫病的流行特点、临床症状、诊断方法以及防治处理等方面做如下报告。　　１材料与方法　　１．１材料　　１．１．１试验动物１头发病死亡的育肥猪；６头活猪，有育肥猪４头、母猪１头

5、和空怀母猪１头，从６头活猪颈静脉随机无菌采集全血，每头约４ｍＬ，得到血液样品。　　１．１．２检测试剂Ｔａｑ酶、ＰＣＲ缓冲液、ｄＮＴＰ为大连宝生物公司产品；蛋白酶Ｋ为Ｍｅｒｃｋ公司产品；弓形虫抗原ＥＬＩＳＡ检测试剂盒购自武汉科前生物技术有限公司；小白鼠购自信阳职业技术学院。染色液有瑞氏染液、ＨＥ染液。　　１．１．３引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ中已登录的猪弓形体基因序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计一对引物，上游引物Ｐ１为５′－ＣＧＴＧＡＣＴＣＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＧＴＣＴＧ－３′；下游引物Ｐ２为５′－ＣＧＣＴＧＣＡＧＡＣ

6、ＡＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＴ－３′。预计ＰＣＲ扩增产物长度为４６３ｂｐ。　　１．１．４主要仪器为实验室现有的ＰＣＲ仪、高速冷冻离心机、尼康Ｅ２００显微镜、尼康４５００数码照相机。　　１．２兽医检查　　１．２．１涂片对发病死亡的育肥猪进行剖检，剖检时，取病死猪的血液、心包液和腹腔液进行涂片，用瑞氏染色法染色后光学显微镜检查，进行流行病学调查。　　１．２．２病理学检查按常规方法对发病死亡的育肥猪进行尸体剖检，记录眼观病变情况。　　１．２．３血清学检测将采集到的４头育肥猪的全血在高速冷冻离心机上５０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ

7、，分离血清。采用猪弓形虫酶联免疫吸附试验进行检测。　　１．３ＰＣＲ检测　　剖解时无菌分别取一块肺脏、肝脏、淋巴结以及脾脏组织，放入无菌塑料袋中，于－７０℃环境备用。　　１．３．１ＤＮＡ的提取取病料肺、肝、淋巴结组织研碎，后加１０倍生理盐水接种小白鼠腹腔，每只接种０．５ｍＬ。待小白鼠出现被毛粗乱、呼吸促迫症状，从其腹水收取弓形虫速殖子，计数后加入ＳＤＳ裂解液和蛋白酶Ｋ，混匀后置于３７℃消化过夜。消化好的虫体悬浮液再加入５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ溶液和５％ＣＴＡＢ溶液，６５℃水浴１０ｍｉｎ；苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液抽提２次，用异丙醇

8、沉淀，７０％乙醇洗涤；适量的灭菌水溶解，－２０℃保存。　　１．３．２ＰＣＲ反应ＰＣＲ反应体系为５０μＬ，ＤＮＡ模板添加量为０．５μｇ。ＰＣＲ反应程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５３℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，３５个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１２ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳观察结果［4-7］