光谱分析技术.ppt

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1、第一节光谱分析技术学习目标1.能说出临床生物化学检验常用分析技术名称2.掌握光的吸收定律，理解吸光系数的意义和应用3.叙述分光光度技术的定量测定方法4.知道火焰光度法、比浊法、原子吸收分光光度法荧光分析法的原理、影响因素和主要应用是能的一种表现形式，是电磁波的一种。光在真空中以直线方式传播，在不同的介质处发生反射、折射、衍射、色散、干涉和偏振等现象。可用波长、频率、传播速度等参量来描述即光具有“波动性”。光的颜色即由光的波长决定，人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400～750nm之间。在可见光之外是红外光760~1000nm紫外光200~400nm什么是光谱分析技术？光的波长（

2、λ）单位用纳米（nm）各种化学物质都具有一定的光谱特性，表现在能选择性吸收、发射或散射某种波长的光。利用物质的吸收光谱、发射光谱或散射光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术称为光谱分析技术。光谱分析技术原理：利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。光谱分析技术分类：发射光谱分析技术：火焰光度法、荧光法吸收光谱分析技术：紫外、红外、原子、可见光分光光度法散射光谱分析技术：比浊法一、分光光度技术的基本原理许多化学物质具有颜色，有些无颜色的化合物也可以与显色剂作用，生成有色物质。实践证明，有色溶液的浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此

3、，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。基于比较颜色深浅对溶液进行定量分析的方法称为比色分析法。光子的能量与波长的关系为E=hυ=hc／λ式中E为光子的能量（J：焦耳），υ为频率，h为普朗克常数（6.63×10-34J·S），c为光速，λ为光的波长因此，不同波长的光，其能量不同，短波能量大，长波能量小。光的显色原理若把某两种颜色的光，按一定的强度比例混合，能够得到白色光，则这两种颜色的光叫做互补色。图中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补色，黄光和蓝光为互补色等等。各种溶液会呈现出不同的颜色，其原因是溶液中有色质点（分子或离

4、子）选择性地吸收某种颜色的光。实验证明：溶液所呈现的颜色是其主要吸收光的互补色。如一束白光通过高锰酸钾溶液时，绿光大部分被选择吸收，其它的光透过溶液。从互补色示意图可以看出，透过光中只剩下紫色光，所以高锰酸钾溶液呈紫色。（二）光的吸收定律溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用吸收定律来描述。它是由约翰·海因里希·朗伯和奥古斯特·比尔相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原子吸收分光光度计也符合这个定律。溶液对光的吸收当一束强度为I的平行单色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光则透过溶液，如图所示结论：I0=Ia+Ir+ItI0--入射光强度Ia--吸收光强度I

5、r--反射光强度It--透射光强度通常由于Ir很小可忽略不计，上式可简化为I0=Ia+It透射光It与入射光强度I0之比为透光率或透光度，用T表示：T=It/I0透光率的负对数称为吸光度或光密度或消光度，用A表示：A=－lgT=lg1/T=lgI0/It蓝色I白光I黄光吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。实验证明：单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为A＝KCL式中：A——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）；K——某溶

6、液的消光（吸收）系数；C——溶液的浓度；L——光程，即溶液的厚度。Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。分光光度计的基本结构可见光光度计721、721-A、722、723型分光光度计等紫外分光光度计751、752、753型分光光度计等紫外-可见分光光度计贝克曼DU500系列紫外/分光光度计吸光（消光）系数表达式吸光系数Aa表示a=C（g/L）.L(cm)单位L/g.cm摩尔消光系数Aε表示ε=C（mol/L）.L(cm)单位L/mol.cm百分消光系数AE表示E=C（g/dl）.L(cm)单位是dL/(g.cm)摩尔消光系数与百分消光系数的换算

7、关系：ε=E*M（摩尔质量）10mol1cm，入1%1cm，入mol1cm，入1%1cm，入一、仪器基本组成光源单色器样品室检测器显示可见分光光度计722型分光光度计示意图722型分光光度计使用方法（1）预热仪器将选择开关置于“T”，打开电源开关，使仪器预热20分钟。为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断。（2）选定波长根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。（3）固定灵敏度档在能使空白溶液很好地调到“100%”的