关于组蛋白高乙酰化介导的Egr.doc

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1、关于组蛋白高乙酰化介导的Egr　　胶质细胞系源性神经营养因子(GNDF)是一种新型的神经营养因子，属于转化生长因子-(TGF-)超家族成员，在胚胎发育过程中的表达量迅速上调，至成年期维持在较低水平。由于GDNF对多巴胺能神经元特异的营养作用，一直作为治疗帕金森病的潜在药物而备受关注。最近的研究表明，GDNF还是胶质瘤细胞强有力的促增殖因子，它在胶质瘤细胞中的表达量显著高于正常胶质细胞，并且能够促进胶质瘤细胞的迁移。目前，有关GDNF对胶质瘤细胞促增殖和迁移机制的研究很多，但是对于gdnf基因高转录的

2、发生机制却知之甚少。基因的异常高转录通常与基因突变以及表观遗传学改变有关。我们前期的研究发现，胶质瘤细胞中gdnf基因的异常高转录与基因突变无关，而与该基因启动子II区组蛋白H3K9的高乙酰化修饰有关。诸多的研究已表明，启动子区组蛋白的高乙酰化修饰可以使该区域染色质中的核小体呈排列松散的开放状态，从而利于转录因子与之的结合，进而促进基因的转录。近来的研究发现，gdnf基因启动子II区转录起始位点上游(-186bp)存在3个连续且高度保守的转录因子Egr-1的结合序列，且Egr-1参与了胶质细胞中成纤

3、维细胞生长因子和丙咪嗪诱导的gdnf转录激活。由此我们推测，胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区组蛋白高乙酰化可能以升高转录因子Egr-1与之结合能力的方式引发该基因的异常高转录。为了验证以上假说，我们以大鼠C6星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞为研究对象，利用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法检测了以上两种细胞中gdnf基因启动子II区Egr-1结合位点区域H3K9的乙酰化水平以及Egr-1与之的结合能力;通过组蛋白乙酰化酶(HAT)抑制剂Curcumin和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂TSA[

4、16]建立的gdnf基因启动子II区乙酰化改变的C6胶质瘤细胞模型，检验了gdnf基因启动子区Egr-1结合位点区域组蛋白乙酰化修饰水平、Egr-1与之的结合能力以及该基因转录水平之间是否存在必然的联系。　　1材料和方法　　主要试剂大鼠C6星形胶质瘤细胞株和正常星形胶质细胞为本实验室冻存。DMEM/F12培养基胎牛血清购自美国Gibco，ChIP级兔源抗乙酰化组蛋白H3(Lys9)多克隆抗体(货号07-352)、EZ-ChIP试剂盒购自Millipore，兔源抗Egr-1多克隆抗体(货号sc-110

5、X)购自SantaCruz，Curcumin、TSA和二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma-Aldrich，TRIzol购自Invitrogen，PrimeScriptTMII逆转录试剂盒、SYBRPremixExTaqTMII试剂盒购自大连TaKaRa。　　细胞培养及药物处理将实验室冻存的大鼠正常星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞复苏于含有10%胎牛血清(美国Gibco)的DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)的培养液中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养，每两天换1次液。取2~3代生长

6、良好的大鼠C6星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞用于后续试验。将处于对数生长期的C6胶质瘤细胞，以1105/ml细胞浓度接种于六孔板，每孔2ml。待细胞生长至80%汇合度时，将培养液更改为含有%牛血清白蛋白(美国Sigma-Aldrich)的无血清Opti-MEM(美国Invitrogen)，在相同条件下培养24h。然后再更换为含有TrichostatinA(终浓度为200nmol/L)或Curcumin(终浓度为50mol/L)(均购自美国Sigma-Aldrich)的新鲜无血清Opti-MEM培养

7、基继续培养24h，其中对照组添加等体积的溶剂DMSO。　　ChIP-PCR染色质免疫共沉淀(ChIP)实验使用兔抗乙酰化H3K9抗体、兔抗Egr-1多克隆抗体和正常兔源IgG，按EZ-ChIPchromatinimmunoprecipitationkit说明书的步骤操作。ChIP实验后，采用real-timePCR的方法检测目的抗体免疫沉淀下来的DNA。PCR反应体系为：lSYBRPremixExTaqTMII;上下游引物(F：5CGAGGAGGTGCAGAGTGAGG3，R：5GGGAG-CAAG

8、AGCACGCAA310mol/L)各1l以及DNA模板3加灭菌消毒的双蒸水补充至总体积25l。用三步法PCR反应程序(预变性：95℃2min;PCR反应：95℃15s，60℃30s，72℃20s，共40个循环)进行扩增。PCR产物大小为283bp。Real-timePCR后采用2-Ct法对数据进行相对定量，以%Input的形式计算结果：%Input=2(CtInput-CtChIP)Inputdilutionfactor100。Real-timePCR引物由康成生物