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1、试剂及器材：真空采血管，酒精，剪刀，碘酒，棉签，抗凝剂肝素钠，一次性针头，冰盒，一次性乳胶手套，标签纸，试管。采用真空采血管收集约15mL健康羊驼(Lamapacos)外周血,用淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单核细胞。采血:采血前,先在羊驼颈部约1/3处找准静脉后剪毛,用碘酒、酒精进行局部消毒（先用25%的碘酒消毒，用棉签画圈消毒，待干后，再用75%酒精消毒两遍）。然后用容积5ml的一次性真空采血管(内含抗凝剂肝素钠,并附有一次性针头)在羊驼的颈静脉采血5.Oml,（采血后，用干棉签按压针头）然后迅速拔出针头,并轻
2、轻转动真空采血管,使血液与抗凝剂充分混和,立即置于装有冰块的冰壶内,并在20h内将冰壶带回实验室。（采血后，取下针头，将血液缓慢沿试管壁注入干试管中，避免震荡以防止血液凝固，加抗凝剂）然后在无菌条件下在每个培养瓶内滴入10一13滴抗凝血,轻轻摇动,使血与培养液充分混和。羊驼外周血单个核细胞的分离和总RNA的提取采取羊驼外周静脉血,以肝素抗凝,,采用密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞,计数细胞,按每10细胞溶于1mlTRIzol中,参照TRIzol试剂使用说明抽提总RNA。提取后的总RNA用DEPC处理过的去离子水
3、溶解,测定浓度,并于-80保存备用。紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性淋巴细胞的分离将采集的羊驼外周血与等体积磷酸缓冲液PBS(pH7．4)混合，淋巴细胞分离液(1．077)离心分离(20℃，800g，15min)，收集淋巴细胞。全血中白细胞的分离抗凝血液样本中加入等体积的PBS缓冲液,混匀;1在一体积足够大的离心管,加入淋巴细胞分离液;2取与淋巴细胞分离液等体积的样本液,将其小心注入淋巴细胞分离液液面上;320℃,800g离心15min;4小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中,加入lxPBS
4、至smL;5取10林L稀释一倍后用血球计数板计数,其余的20℃,8009离心15min:6弃上清,在沉淀(白细胞)中加入裂解液(RNAiso),体积比l:20;7用移液器反复吹吸至裂解液中无明显沉淀;8在15一300C,静置5min。总RNA提取1加入1/5体积氯仿,用力振荡至充分乳化(约15s),室温静置5min;212000g,4℃,15min:3小心取出离心管,取上清液转移至新离心管;4加入等体积异丙醇,颠倒混匀,15一30℃静置10min;5120009,4℃,10min:6弃去上清;7缓慢沿管壁加入1mL
5、75%乙醇,上下颠倒;812000g,4℃,5min;9去乙醇;11取1uL总RNA在ND1000紫外分光光度计上分别测定230nm、260nm、280lun和320nm处的吸光度值;12通过计算OD26。、OD260/OD28。确定总RNA的数量与质量;13取2uL总RNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。
