人类肠道病毒74、80和87型山东地方株的鉴定及基因特征分析.pdf

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1、第28卷第6期病毒学报V0lJ28No．62012年11月CHINESEjoURNALOFVIR0L0GYNovember2O12人类肠道病毒74、80和87型山东地方株的鉴定及基因特征分析陶泽新，刘尧，宋立志，王海岩，陈鹏，徐爱强(1．山东省疾病预防控制中心山东省传染病预防控制重点实验室，济南250014；2．山东大学公共卫生学院，济南250012)摘要：随着基于VP1序列分析的分子定型方法的推广应用，许多新型人类肠道病毒(Humanenterovirus，HEV)陆续被发现。本研究通过对1989～2010年山东省急性弛缓性麻痹(Acuteflaccidparalysis，AFP)监

2、测系统分离到的非脊髓灰质炎肠道病毒进行VP1完整编码区的序列扩增及分子定型，共发现1株EV74，3株EV80和1株EV87。同源性分析显示EV74、EV80和EV87山东分离株与原型株的核苷酸同源性分别为81．4，76．4～81．7以及8O．3。系统发生学分析显示山东地方株与国内外其他分离株的亲缘关系均较远。这是在中国大陆地区首次发现EV74和EV87，其中EV87山东分离株为全球第2个鉴定出的分离株。这3种新型HEV在AFP监测系统中的分离率较低，提示尚未在我国导致大规模流行。关键词：新型肠道病毒；急性弛缓性麻痹；分子进化；基因特征中图分类号：R373．2文献标识码：A文章编号：10

3、00—8721(2012)06—0658—05人类肠道病毒(Humanenterovirus，HEV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属材料与方法(Enterovirus)，目前有A、B、C、D4个组共100多种血清型_1]。HEV抗原型别复杂，进化活跃。19991毒株来源本研究所用HEV毒株来自山东省年，Oberste等提出的VP1基因序列的分子定型方1989～2011年AFP监测系统病例分离株。毒株法¨2]，许多使用传统血清学方法无法定型的HEV在一80℃冰箱中冻存，实验前接种RD细胞进行病毒陆续被发现，目前已有50多个新型HEV血清型，增殖。而且随着分子

4、定型方法的推广，将来还会发现更多2病毒RNA的提取采用美国QIAGEN公司的的新型HEV。QIAampViralRNAMiniKit试剂盒，按照说明书在前期研究中，通过对山东省1989~2010年急操作，从140／,1细胞培养物中提取病毒RNA，溶于性弛缓性麻痹(Acuteflaccidparalysis，AFP)监测50l无菌无核酸酶水中，加如1F1(40U)Rnasin系统中分离到的部分非脊髓灰质炎肠道病毒(Non-(QIAGEN)，储存于一80℃。polioenterovirus，NPEV)进行分子定型，初步探索3RT—PCR及VP1区核苷酸序列测定参照文了山东省人类肠道病毒的基

5、因型分布_3]，并发现了献。=合成引物对008／013、187／011，扩增VP1完新型人类肠道病毒EV73、EV75、EV76、EV90、整编码区序列。RT—PCR反应采用美国PromegaEV96和EV97等血清型_3。本研究继续对其他公司AccessRT—PCRSystem一步法试剂盒，反应AFP病例分离株进行鉴定，又发现了3种新型条件为45℃45min，94℃2min；94℃2OS，50℃HEV，即EV74、EV8O和EV87，并对其VP1编码50S，72℃5OS，35个循环；72℃7min。PCR产物区序列特征进行了探讨。经1琼脂糖凝胶电泳，阳性产物送北京六合华大基因科技股份

6、有限公司，分别以引物008和187进行标记和序列测定。收稿日期：2012-06—07；修回日期：2012—09—044序列分析测序结果使用RIVM的HEV在线基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目课题(2011QZ013)分子定型工具(http：／／www．rivm．nl／mpf／entero—作者简介：陶泽新(1979一)，男，山东昌邑人，博士，主管医师，主virus／typingtOO1)进行型别鉴定[u]。使用BioEdit要从事肠道病毒方面的研究，Tel：0531—82679698，E—mail：zexin．tao7．1．3软件对山东地方株及各型代表株的VP1核@163．co

7、m*通讯作者：徐爱强，主任医师，Tel：0531-82679606，E-mail：苷酸序列进行同源性比较。使用Mega4．0软件通aqxuepi@163．com过邻位法(Neighbor—Joiningmethod)进行系统发生6期陶泽新等：人类肠道病毒74、8O和87型山东地方株的鉴定及基因特征分析·659·学分析，建树的可靠性通过1000bootstrap评估。本研究5株病毒均分离自RD细胞，均产生具有HEV特征性的CPE，细胞圆缩、裂解、