土壤宏蛋白质组学

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1、宏蛋白质组学：研究微生物群落新策略学生：王秀玲导师：李潮海教授2012-12-15郑州CompanyLOGOCompanyLogo报告提纲1宏蛋白质组学的产生2宏蛋白质组学的研究策略3宏蛋白质组学的应用CompanyLogo1.宏蛋白质组学的产生20世纪60年代，大多数研究依赖于单菌培养，但是这种方法难以反映微生物及微生物预期环境之间的相互作用；Brock(1987)认为实验室条件下培养的微生物传统的分离培养方法极大地限制了人特性并不能反映其在自然环境下的活性与生理们认识微生物世界机能，因为在自然环境下资源竞争、环境不均的视野。等、捕食和

2、其他作用的影响是不可忽略的；地球上绝大部分微生物(约99％)是未培养微生物，即指那些利用分子生物学技术能够检测到，迄今所采用的微生物纯培养分离、培养方法还未获得纯培养的微生物。CompanyLogo1.宏蛋白质组学的产生蛋白质组宏基因组概念的提出概念的提出宏蛋白质组蛋白质组学是研究指环境混合微生一种细胞乃至一种物群落中所有生生物所表达的全部特定环境或共生体物的蛋白质组总蛋白质的生理结构内所有生物遗传物和。宏蛋白质组与代谢过程的科学质的总和，是一种学则是针对某一，但是对于组成复不依赖于人工培养特定地点的微生杂的天然样品或含的微生物基因组分物

3、群落所产生的有大量不可培养微析技术。全部蛋白质而进生物的自然微生物行大规模研究的区系，还很不足。方法。CompanyLogo2.宏蛋白质组学研究的研究策略CompanyLogo2.1.环境微生物样品粗蛋白样品制备原位收集法浸出收集法在尽量不破坏土壤原有用各种酸、碱或盐结构和状态的情况下收等溶液讲土壤中可集土壤溶液，能够较真实反映土壤溶液的真实溶性成分浸提出来状况；只能收集游离的，不同的提取液、、溶解的蛋白质组分，提取时间、提取受土壤含水量限制，往往收集到的土壤溶液很pH均会影响提取少，组分含量也较低效果CompanyLogo2.2.获取微

4、生物蛋白分组收集Text蛋白质分子土壤蛋白质量大小来源和分布Watanabe实验目的•胞外蛋白质等用3个不同•细胞蛋白截留分子量•总蛋白蛋白种类的超滤膜法将蛋白质根后续研究方法据分子量大小分为三组CompanyLogo2.22.2..1.1.总蛋白提取（直接提取法）�直接提取法提取土壤总蛋白，通常需要原位裂解，以释放更多的土壤蛋白.原位裂解能提供样品中细菌、真菌、原生动物等所产生的全部蛋白混合物，�但这种混合也会造成分类学上的困难；�由于干扰物的存在，直接裂解应用到天然环境蛋白提取中仍存在很大的技术困难.�“分步提取法”（先从土壤样品中提

5、取蛋白质、微生物、腐殖酸等，然后再经过一步酚抽提，将蛋白和腐殖酸分开，然后进行蛋白质组学研究），该方法有利于土壤宏蛋白质组学的功能分析，可以分别提取细胞内蛋白和胞外蛋白，但是蛋白质得率很低，需要经过预培养或接种才能获得足够分析的蛋白质含量。CompanyLogo2.22.2..2.2.胞外蛋白�胞外蛋白质来自裂解的细胞、细胞分泌的酶或其他活性蛋白，游离或吸附在土壤基质上，能够被土壤通过各种机制稳定存在于土壤基质中.对土壤中稳定胞外蛋白质为研究对象的蛋白质组学又称土壤结构蛋白质组学。�胞外蛋白的提取一般不需要裂解，用0.22μm的滤膜就可以

6、达到初步分离的目的。但由于土壤胞外蛋白的低丰度性，有时还要求保持活性，使得对其的提取更难，电泳分离的胞外蛋白数量明显小于胞内蛋白.CompanyLogo2.22.2..3.3.胞内蛋白�细胞内蛋白提取采取的策略一般有直接提取法和先收集细胞再提取蛋白法（DGC-EXT），后者又称间接提取法.�直接提取法是指采用原位或浸出法直接提取出总蛋白，再通过过膜、沉淀（如苯酚沉淀）、离心（如密度梯度离心）等纯化分离手段分离出细胞蛋白；�间接法则指先通过过膜、离心、沉淀等方法将细胞分离出来，再裂解提取细胞蛋白；�Chourey等提出了一个新的微生物蛋白直

7、接提取法——SDS-TCA法，即同时采用SDS、加热两种变性方法，结合TCA沉淀，丙酮洗涤等步骤，提取出适合液质联用分析的样品。在不同土壤样品中均能鉴定出500个以上的蛋白。与间接法相比，表现出明显的优势，认为是目前为此最有效的用于土壤微生物蛋白质组学的提取方法。CompanyLogo2.22.2..获取微生物蛋白�此外，如果能够清楚地知道某一生境中微生物的组成，然后再模拟天然生境，培养微生物，能明显提高微生物蛋白提取效率。�Taylor用DGC-EXT提取蛋白，SDS-PAGE后图像有6~10条带，加入葡萄糖和甲苯培养后的土壤蛋白质条带

8、增加至40个。�模拟生境先培养后提取的方法也有局限性，对于某些组成相对简单，某种或某几种微生物占绝对优势的样品来说，这一方法是可行的，但对于这里讨论的宏蛋白质组学来说，由于人为降低了样本复杂性