垂直电泳系统工作原理

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1、教案课程名称分子生物学实验授课题目（章、节）实验二授课教师陈永燕迟彦授课对象生物工程031授课时间8学时教学方法实际操作（分组实验）选用教具授课内容提要及时间分配：（8学时）实验二DNA的检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA紫外风光光度计检测DNA的浓度和纯度[实验目的]通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术[实验原理]DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不

2、一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。[实验步骤]1．制备1％的琼脂糖凝胶溶液；2．封闭有机玻璃内槽，放好梳子，倒胶；3．用移液器将混和了上样缓冲液的DNA样品加入点样孔；4．接通电源电泳；5．观察实验结果[注意事项]1.溴化乙锭是强烈致癌剂，在操作过程中注意戴手套；2.处理稀EB溶液的方法：1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；2）于室温放置1小时，不时搅动；3）用Whatman1号滤纸过滤溶液，滤液可从下水道丢弃；4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为

3、有害废物予以丢弃。大连大学教学重点、难点及基本要求：掌握琼脂糖凝胶电泳的分离DNA的原理；制胶流程；制胶注意事项。作业与思考题：1.琼脂糖凝胶电泳实验原理?2.影响电泳迁移的主要因素?3.凝胶上样缓冲液（loadingbuffer）的作用?4.DNA染料EB（ethidiumbromide）的作用?5.琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺分离DNA分子大小范围?6.DNA纯制品，OD260/OD280=？RNA纯制品，OD260/OD280=？什么情况下DNA样品比值偏高或偏低。单元教学小结（经验效果、问题、改进措施、信息反馈等）琼脂糖凝胶电泳检

4、测DNA一：讲解相关知识：1电泳（electrophoresis)：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。2琼脂糖(agarose)：线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取出来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固形成良好的电泳介质。琼脂糖凝胶可形成三维筛孔的通道。3凝胶浓度决定孔径大小凝胶浓度越大，形成的孔径越小，则分辨率越大凝胶浓度越小，形成的孔径越大，则分辨率越小4实验原理：DNA琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定、纯化DNA的分子生物学最常用的技术。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中，向？？移动。5影响电泳迁移

5、的主要因素：•琼脂糖浓度•DNA的大小•DNA的构象•缓冲液6分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度7不同构型质粒迁移速率：超螺旋＞线状＞开环DNA8缓冲液•TAE：乙酸盐缓冲液•TBE：硼酸盐缓冲液•TPE：磷酸盐缓冲液TAE缓冲液缓冲能力较二者弱；TAE缓冲液在分离分子量较小的DNA分子时，迁移速率比TBE和TPE快；TAE对于分子量较大的DNA分子，具有较好的分辨率。TPE凝胶回收DNA片段中含有较高的磷酸盐，易与DNA形成沉淀，影响酶反应。9指示剂：凝胶上样缓冲液（loadingbuffer）有三种作用：1.增加DNA密

6、度2.便于加样3.溴酚蓝的迁移速率同300bp的双链DNA分子迁移速率相同。10DNA染料：EB（ethidiumbromide两个特性：它可嵌入到核酸分子的碱基中，但不会和琼脂糖等介质结合。它可在300nm的波长下发出荧光。二：讲解实验原理，步骤，注意事项[实验原理]DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的

7、DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(opencircularDNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂(linearDNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常

8、抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪(二)材料1