基因工程技术与应用知识点.doc

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1、基因工程的定义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。基因工程的基本过程：切、接、转、增、检基因工程理论依据：a)生物的遗传物质是DNA。b)DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。c)遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立遗传工程：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程和基因工程等不同的技术层次。克

2、隆。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。限制性核酸内切酶。是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。限制性内切酶由三个基因位点所控制：hsdR---限制性内切酶，hsdM---限制性甲基化酶，hsdS---控制两个系统的表达。HsdS－识别特定DNA序列，HsdM－甲基化，HsdR－限制性内切酶功能。命名法：例如Haemophilusinfluenzue）d株中分离的第三个酶：HindIII同裂酶:不同来源的限制酶具有相同的识别位点和切

3、割位点。同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶粘性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称之。酶活性单位。在合适的温度和缓冲液中，在50μl反应体系中，1小时内完全切割1微克DNA所需的酶量为1个酶活性单位U。星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。引起星活性原因：若使用buffer不当,会有staractivity，而staractivity是指限制酶对所作用的DNA及序列失去专

4、一性,当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用，而产生错误的结果。连杆：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。底物位点优势效应:酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同衔接头：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。逆转录酶：以mRNA为模板合成其互补DNA。RNA聚合酶：以DNA为模板

5、合成mRNA，不需引物，但必须有启动子。末端转移酶：不依赖于DNA的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3¢端增加一个或多个脱氧核苷酸。多核苷酸激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。防止载体分子的自身环化作用：使用不同的限制酶切；碱性磷酸酶预先处理质粒载体；DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接。；DNA片段末端同聚物加尾后进行连接载体：指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。功能：1运送外源基因高效转入受体细胞2为外源

6、基因提供复制能力或整合能力3为外源基因的扩增或表达提供条作为工程载体必备的条件：具有多个单一的限制酶切位点；有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有筛选转化子的选择性标记基因；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中；分子量小，拷贝数多；携带外源基因的幅度宽。克隆载体：用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。表达载体。指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的载体，可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载

7、的目的基因能够复制、转录和翻译。穿梭载体：能在两种不同的生物体内复制的载体。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移质粒：指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。严谨型质粒:拷贝数为1至几个的质粒。松弛型质粒:拷贝数多于10个的质粒。氯霉素扩增：用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒扔会利用丰富的原料大量复制的的现象。质粒不亲和性：指在无选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。接合质粒。指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便

8、将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞的质粒。质粒有哪些性质：自主复制性、可扩增性、不亲和性、转移和迁移、重组性。cos位点：指在连接酶的作用下，连接黏性末端结合形成的双链DNA区