淀粉酶及可溶性糖的测定.doc

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1、水稻种子萌发后淀粉酶活力的测定【实验原理】种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉酶分解为麦芽糖：2（C6H10O5）n+nH2OnC12H22O11淀粉麦芽糖麦芽糖有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸：产物3-氨基-5硝基水杨酸呈棕色，可用分光光度计测定。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸账萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。【仪器、材料与试剂】（一）仪器分光光度计、离心机、恒温箱、恒温水浴锅、25mL刻度试管、乳钵、离心管（二）材料水稻种子、芽糖、淀粉、3,5-二硝基水杨

2、酸、酒石酸钾钠、细砂、磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠（NaOH）（三）试剂1.1g/L标准麦芽糖溶液20mL精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL量瓶中，用蒸馏水定容。2.0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.9）100mL0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.02mol/L磷酸氢二钾82.5mL混合，稀释10倍。3.10g/L淀粉溶液100mL1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。4.10g

3、/L3,5-二硝基水杨酸试剂100mL1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL2mol/L的氢氧化钠溶液和50mL水中，再加入30g酒石酸钾钠，定容至100mL。若溶液浑浊，可以过滤。5.10g/L氯化钠溶液300mL6.细砂5g【实验步骤】1.种子发芽种子浸泡处理后，放入培养皿中在人工气候室内发芽。2.酶液提取取发芽4天左右的幼苗15株，放入乳钵内，加入细砂200mg，加10g/L氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20min，搅拌几次。然后将提取液1500r/min离心6-7min。将上清液倒入量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶

4、活力测定时，用缓冲液将酶提取液稀释10倍。另取未萌发的水稻种子15粒作为对照（提取步骤同上）。3.酶活力测定（1）取25mL刻度试管8支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须要在25℃预热10min）。试管标号试剂12345种颜色照射下发芽种子的酶提取液各一支（红色、绿色、黄色、白色、黑色）未萌发种子的酶的提取液标准管空白管酶液/mL0.50.5——标准麦芽糖溶液/mL——0.5—10g/L淀粉溶液/mL1.01.01.01.0水/mL———0.5将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3min后立即向各管中加入100g/L3,5-二硝基水

5、杨酸溶液2mL。（3）取出各试管，放入沸水浴中加热5min。冷却至室温加水稀释至25mL。将各管充分混匀。（4）用空白管作对照，在500nm处测定各管的吸光度值。【实验结果】1.将500nm波长处读取的数值填入下表：试管号15种颜色照射下发芽种子的酶提取液各一支（红色、绿色、黄色、白色、黑色）2未萌发种子的酶的提取液3标准4空白A500nm2.关于麦芽糖浓度的计算根据溶液的浓度与吸光度值成正比的关系，即：，则c（酶液管中麦芽糖的浓度）=式中，c为浓度；A为吸光度值。规定：25℃时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力

6、单位。则15粒种子的总活力单位=式中，为酶液中麦芽糖的浓度；为酶液稀释倍数；为提取酶液的总体积。水稻种子萌发后可溶性糖的测定【实验原理】糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，反应如下：糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。【实验材料、仪器及试剂】（一）材料培养4天左右的水稻种子、未萌发的水稻种子（二）仪器分光光度计、恒温水箱、20mL试管（3支）、

7、漏斗、100mL容量瓶、刻度试管、试管架、研钵（三）试剂：（1）100μg/mL标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至1000mL。（2）蒽酮试剂：0.2g蒽酮，溶于100mL浓硫酸中。当日配制使用。棕色瓶避光处贮藏。（3）浓硫酸。【实验步骤】1.葡萄糖标准曲线的制作取7支20mL试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入4mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管完成后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。置沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度

8、值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。管号1234567标准葡萄糖原液（mL）（100μg/mL）00.20.30.40.50.60.8蒸馏水1.00.80.70.60.50.40.2葡萄