微透析法测定葛根素的体外血浆蛋白结合率-论文.pdf

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1、中国中医药科技2014年7月第21卷第4期July2014V01．2lNo．4·395·微透析法测定葛根素的体外血浆蛋白结合率球董文彬陈爱瑛程敏王军青郑高利(浙江省医学科学院·杭州310013)摘要目的：采用微透析技术测定葛根素的体外血浆蛋白结合率，并与超滤法比较。方法：微透析探针依次浸入含葛根素2【】、60、200mL的大鼠、人血浆中，灌注器以2．5L／min的流速依次灌注含葛根素O、1O、30、100、300tzg／mL的林格氏液，每l5分钟收集1次样品，HPLC分析葛根素浓度。以灌注液与透析液中葛根素的浓度差对灌注液浓度进行线性回归，计

2、算血浆中游离葛根素的浓度，进而计算葛根素的血浆蛋白结合率，并与超滤法进行比较。结果：微透析法测定葛根素与大鼠、人血浆蛋白结合率平均值分别为31．14％、29．92％，超滤法分别为28．57％、28．83％，两种方法结果比较接近。结论：葛根素与大鼠、人血浆蛋白有较低的结合率，微透析法和超滤法结果一致。关键词葛根索体外血浆蛋白结合率微透析法大鼠药物进入血液循环后，可不同程度的与血浆蛋白结合，2实验方法并处于动态平衡中，影响着药物在体内的分布、代谢及排泄，2．1色谱条件Cl8柱(4．6mm×250mm，5m)，柱温与药物的药理作用密切相关。目前研究

3、血浆蛋白结合率的25，流动相为0．1％枸橼酸溶液：甲醇=75：25，流速方法主要有平衡透析法、超滤法和微透析法等，各有其优缺1．0mL／min，进样201~L，检测波长250nm。点。其中微透析技术是一种新型采样技术，可实时动态采2．2标准曲线的制备精密称取葛根素对照品适量，用林样，在药代动力学研究中得到了广泛的应用。格氏液配制成0．0296、0．296、2．96、29．6、296~g／mL的葛根葛根素(puerarin)是从豆科植物野葛的干燥根中提取的素对照品液，分别取每个浓度的对照品液进样HPLC分析，天然活性成分，具有降低心肌耗氧量、扩

4、张血管、抗血小板聚每个对照品液连续进样3次，取均值作为该浓度的峰面积。集、抗氧化等多种药理作用，对心脑血管疾病如冠心病、心绞取0．0296、2．96、296~g／mL3个浓度的葛根素对照品液痛、脑缺血等具有明确的治疗作用“J。本文拟采用微透析1天内连续进样5次，考察日内精密度；连续5天进样，每天技术研究葛根素与人、大鼠血浆的蛋白结合率，并与传统的进样1次，考察日间精密度。超滤法进行比较，以期为葛根素的临床应用提供参考。2．3阴性干扰实验将微透析探针浸于大鼠、人空白血浆1材料中，血浆维持37~C恒温水浴并采用磁振子匀速搅拌。以林1．1仪器Wat

5、ersBreeze2高效液相色谱仪：1525二元格氏液为灌注液，2．5p~L／min的流速进行灌注，平衡30分钟HPLC泵，2489紫外／可见光检测器；微透析设备：[灌注器推后每隔15分钟收集一次样品，共收集3次，进样HPLC进泵(BabyBeeSyringeDrive，MD1001)、灌注器(1mLBee分析。StingerGastightSyringe，MD0100)、流速控制器(WorkBee另取大鼠、人空白血浆置于超滤管中，7200r／min离心Controller，MD1000)]：均为美国BAS公司产品；JVM01血管15分钟，取

6、超滤液进样HPLC分析。微透析探针：浙江大学生仪学院提供，活性透析膜长度为2．4超滤膜回收率考察分别取20、60、2001~g／mL的葛根lOmm，相对分子量截留值为18kD；超滤管：Millopore公司，素林格氏液各5001xL于超滤管中，7200r／min离心15分钟，相对分子量截留值为10kD；$21—1恒温磁力搅拌器：上海司取上清进样HPLC分析，记录峰面积，并以相同浓度未超滤乐仪器厂。的葛根素林格式液比计算回收率。1．2药品与试剂葛根素样6占：西安开来生物工程有限公2．5含药血浆的制备大鼠心脏采血，肝素抗凝，离心取上司，批号：K1

7、20811，纯度>99％；葛根素对照品：中国药品生清得血浆，冰箱保存备用。另精密称取葛根素样品适量，用物制品检定所，批号：110752—201112。肝素钠注射液：上海pH7．4的磷酸盐缓冲液(PBS)配制成浓度为0．4、1．2、第一生化药业有限公司；人空r_1血浆：浙江大学医学院附属4．0mg／mL的葛根素溶液。分别精密吸取0．5mL上述药液第二医院；枸橼酸为分析纯，甲醇为色谱纯，水为超纯水。加入到9．5mL的大鼠血浆中，涡旋1分钟后，置于37℃水浴1．3实验动物SD大鼠，体重(300±20)g，清洁级，购自浙温浴4小时并搅拌混合均匀，得到

8、浓度分别为20、60、江省实验动物中心，合格证号：SCXK(浙)2008—0033。2001．tg／mI的大鼠含药血浆。参考上述方法制备20、60、200g／mL的