纳米TiO_2固载脂肪酶及其固载界面表征-论文.pdf

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1、第29卷第2期安徽工程大学学报V01．29．No．22014年6月JournalofAnhuiPolytechnicUniversityJun．，2014文章编号：16722—477(2014)02—0009—04纳米TiO2固载脂肪酶及其固载界面表征周朋，陶玉贵，曹宁，张健，刘任龙(安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000)摘要：以3种不同形貌的纳米TiO。为载体固定化脂肪酶，研究载体形貌、酶添加量、pH值、温度和时间对固载酶活性的影响．研究结果表明，纳米线形貌TiOz固定化效果最好，最

2、优固定化条件为加酶量0．25g／25mL溶液、pH7．0、固载温度4O℃、固载时间6．3h．利用SEM、XRD、FT—IR等对固载酶及其界面进行表征，SEM和XRD结果表明，脂肪酶吸附于纳米线TiO。载体表面，且未改变纳米线TiOz的晶型结构；FT—IR表征表明固载酶含有脂肪酶的特征吸收峰；比表面积分析显示固定化后样品的BET明显减小，表明脂肪酶在纳米线TiOz表面进行物理型吸附．关键词：纳米TiOz；脂肪酶；固定化；表征中图分类号：TB34文献标识码：A脂肪酶又称三酰甘油酯水解酶(EC3．1．1．3

3、)，可以专一高效地催化分解甘油三酯，普遍存在于动植物和微生物中[1]．脂肪酶广泛应用于医药、化工、食品和化妆品等行业[4]．相较于游离酶而言，固定化酶有着更好的操作稳定性，有利于下游产物的分离纯化，便于回收重复利用[6]．目前，利用纳米无机材料作为酶固定化的载体已得到广泛应用[7]．无机材料TiO对有机物质具有较好的吸附性，生物亲和性好、无毒害，化学稳定性好，机械强度高，将会是很好的酶固定化载体Dqo]．在酶的固定化中，酶与载体表面的作用方式可能会引起酶结构的变异，增加底物与酶活中心的空间位阻，从而导

4、致酶活力下降、酶固定量也受到限制．因而，研究酶蛋白在载体表面的界面特性是酶固定化的关键[1．本文在前期仿生合成纳米TiO。基础上，分别以仿生合成的纳米线、纳米花以及纳米片TiO为载体进行脂肪酶固定化，进一步研究固定化效果最好的载体．采用SEM、XRD、FT—IR以及比表面积分析仪等表征固定化酶，对纳米TiO载体固定脂肪酶的界面特性进行了初步探究．1实验部分1．1实验药品脂肪酶，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，聚乙烯醇(PVP)，无水乙醇，橄榄油，均为化学纯，国药集团化学试剂有限公司；TiO2纳米线(锐钛矿，S

5、哪一312．58IT1。／g，PoreRadiusDv(r)一16．69am)、纳米花(Tio2／ZnO复合体，SBET=219．54m。／g，PoreRadiusDv(r)一18．53nm)以及纳米片(钛酸盐，SBET=169．50m。／g，PoreRadiusDv(r)：48．44nm)载体均为实验室自制．1．2酶固定化方法在25mL浓度为0．1mol／L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH一7．5)中加入一定量的酶粉，搅拌0．5h使之充分溶解．然后将0．5g载体(静置在pH=7．0，浓度0．1mol／

6、mL的磷酸缓冲溶液24h)加入脂肪酶的PBS中，室温下搅拌一定时间，过滤，将固定化酶用滤液反覆洗涤，收集滤液，滤液待用，以便测定滤液中酶的活力．所得的固体干燥至恒重，得到固定化酶．1．3蛋白负载率和酶活测定方法固定化酶蛋白含量的测定采用Brandford法．固定化效率()=(初始酶液总蛋白一残液总蛋白)／W始酶液总蛋白X100．固定化酶活力采用橄榄油乳化及NaOH滴定法测定．固定化酶活力单位：每克固定化酶在37℃下，收稿日期：2013—05—22基金项目：安徽省高校自然科学基金资助项目(KJ2012A

7、034)；安徽省自然科学基金资助项目(130808MC51)作者简介：周朋(1983一)，男，安徽芜湖人，助理实验师，硕士．通讯作者：陶玉贵(1965一)，男，安徽无为人，教授，硕导．安徽工程大学学报第29卷每分钟水解橄榄油产生1mo1脂肪酸所需的酶量为1个活力单位(U／g)．1．4表征方法采用日立S-48O0扫描电子显微镜研究样品形貌；在BrukerD8Advance型X射线衍射仪上进行XRD表征，采用连续扫描方式，扫描范围20=10。～8O。；利用岛津IRPrestige一21傅立叶变换红外光谱仪

8、研究样品中基团的变化；通过美国康塔NOVA2000e比表面积及孔径分析仪测试样品的比表面积．2结果与讨论2．1纳米TiO形貌对酶固载率的影响分别以自制的线状、花状和片状TiOz为载体，在相同条件下固定化脂肪酶，再测定固定化酶的活力和固载率，实验结果如图1所示．由图1可知，3种载体中线型形貌载体的固载率最高，且酶活也较好．纳啪霉■，咖／flv＼咖麟蕾雌咖匿米线型的TiO。为纯的锐钛矿，在3种载体中具有较高的BET、孔径与脂肪酶也较为接近．因而，最终选择％，