固体平板转化法检测细菌质粒DNA水平转移现象.ppt

《固体平板转化法检测细菌质粒DNA水平转移现象.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、固体平板转化法检测细菌质粒DNA的水平转移现象实验目的1、了解细菌水平基因转移的主要途径、基本原理；2、学习大肠杆菌固体平板转化实验的基本方法。许多细菌可以建立自然感受态，能从环境中摄取DNA改变自身遗传结构，获得新的表型。细菌转化是水平基因转移的重要途径之一。Dubnau,AnnuRevMicrobiol,199953:217-44大肠杆菌氯化钙平板转化方法1、菌种活化：挑取大肠杆菌单菌落接种于5mLLB培养基中，37℃振荡培养过夜；2、菌液准备（1）按1/100转接量，转接于50mL新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.5~0.55（3h左右

2、）。（2）按3mL分装到无菌试管中，置冰浴。3、转化选择平板准备先摇匀融化好的150mL的LB，在50~60℃时，加入150L100mg/mL的氨苄青霉素（终浓度100g/mL），混匀，倒9块平板（每组4块）；置45℃预热；4、感受态制备及转化（按4人小组进行）（1）用移液器取1mL菌液于1.5mL微量离心管中，每小组取2支；冰浴冷却5~10min；★冰浴很重要！已冰浴的菌液可适当缩短冷却时间。（2）12000r/min离心30s，弃上清，用移液器吸去残液，保留菌体沉淀；（3）每支微量离心管中各加入50L新鲜LB培养基，重悬细胞；4、感受态制备及转化（

3、按4人小组进行）（4）合并两支管中的菌悬液，取80L菌悬液加入装有1LpDsRED质粒（620ng/L）微量离心管(500L)中，混匀，冰浴5~10min；等体积加入室温氯化钙溶液；冰浴5~10min；（5）分别取20、40、80L转化混合物涂布于45℃预热的选择平板；（6）步骤（4）剩余的20L菌悬液直接涂布于选择平板，作为阴性对照；（7）37℃倒置培养20h后计算转化频率。1mL菌液X2冰浴12000r/min离心30s50LLB*2重悬细胞注意平衡！吸弃上清保留沉淀合并菌悬液80L加入到质粒管20L细胞悬液冰浴5~10min加入等体积

4、氯化钙溶液冰浴5~10min涂布预热的氨苄选择平板分别取20、40、80L20L结果与分析根据平板上转化子数与平板内转化混合物涂布量计算转化频率或效率（菌浓度按2×1010CFU/mL计）；转化频率=转化子数/活菌总数转化效率=转化子数/g转化DNA思考题将“剩余的20L菌悬液直接涂布于选择平板”作为对照的目的是什么？