实验6、培养基的制备及灭菌.doc

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1、实验六、培养基的制备与灭菌一、实验目的1.掌握几种常用培养基的配置方法；2.掌握儿种常用的灭菌方法及其原理。二、实验原理山于微生物的种类及代谢类型多种多样，因而用于培养微生物的培养基种类也很多。进一步理解培养基配置的基本原则。三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白月东、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素1mol/LNaOH,lmol/LHCI,KNO3、NaCKK2HPO4・3出0、MgSO4・7H?0、FeS04-7H20=试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。四、实验步骤（一）牛肉膏蛋白豚培养基的配制牛肉膏蛋口

2、豚培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。英配方如下：牛肉膏3g,蛋白腺10g,NaCI5g,琼脂15-20g,水lOOOmL,pH7.4-76称药品——加热溶解——调pH——过滤——分装——加棉塞——包扎一一灭菌——摆斜面一一无菌检查1.称药品按实际用量计算后，按配方称収各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或衣面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取岀纸片。蛋白陈极易吸潮，故称量时要迅速。2.加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药晶完全溶解后再补充

3、水分至所需帚。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶解的药阳中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。3.调pH检测培养基的pH,若pH偏酸，可滴加lmol/LNaOH,边加边搅拌，并随时■用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用Imol/LHC1进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不耍调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4.过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5.分装按实验要求，可将呢制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装

4、吋可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5,灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6.加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法如图。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶II内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或豹料塞代替棉塞。7.包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸

5、，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装手试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。1.灭菌将上述培养基于121.3°C湿热灭菌20mino如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。2.摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2。3.无菌检查将灭菌的培养基放入37°C温箱中培养24-48h,无菌生长即可使用。或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。（二）高氏1号培养基的配制髙氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：可溶性淀粉20g,KNO

6、31g,NaCl0.5g,K2HPO4・3H2O0.5g,MgSO4・7H2O0.5g,FeSO4.7H2OO.Olg,琼脂15—20g,水1000ML,pH7.4一7.6。1.称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶生淀粉，放入小烧杯中,并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至英完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微最成分FeS04.7出0可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入lg的FeS04.7比0,配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000ML培养基中加入以上贮备液ImL即可。待所有药品完全溶解

7、后，补充水分到所需的总体积。如要配制固休培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白月东培养基配制。2.pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检杳同牛肉膏蛋白腺培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。英陀方如下：K2HP04lg,MgSO4.7H200.5g,蛋白月东5g,葡萄糖lOg,琼脂15-20g,水1000ML,自然pH。1..称量和溶解先计算后称量，按用量称収各成分.并将其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000ML培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL,混