小鼠胚胎干细胞药物代谢酶cyp3a11基因敲除的实验研究

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1、±里垦塑垫201o年8月第5卷第4期ChinMedBiotechnol，August2010，Vo1．5，No．4DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673．713X．2010．04．007·论著·小鼠胚胎干细胞药物代谢酶CYP3al1基因敲除的实验研究曾军，王雪丁，陈宏远，黄民，杜军【摘要】El4胚胎干细胞(embryostemcell，EScel1)的目的研究小鼠胚胎干细胞药物代谢酶CYP3al1基因的CYP3a11基因进行了敲除，为进一步制作CYP3al1敲除。基因缺陷型小鼠作准

2、备。方法根据己知小鼠的CYP3al1基因组DNA序列，从129品系小鼠E14胚胎干细胞基因组DNA中，通过1材料与方法PCR的方法分别获得用于构建基因敲除载体的0．65kb的1．1材料5’一短臂(shortanl'l，SA)和(3．3+4)kb的3’一长臂(1ong1．1．1质粒、菌株和Es细胞株质粒pBluescriptam，LA)片段，通过常规分子克隆技术，构建完成针对小IISK+phagemid为美国Stratagene公司产品；鼠药物代谢酶CYP3al1基因的替代型基因敲除载体pCR2．1-

3、TOPO为美国Invitrogen公司产品；大肠pCR-CYP3all杆菌DH5c~由本室保存；129品系小鼠El4ES—KO，并对载体进行酶切鉴定。将线性化的pCR．CYP3all—KO载体通过电穿孔技术转入El4胚胎干细胞株为中科院上海生化与细胞研究所提供；ES细胞。G418药物筛选4—6周直至克隆形成，用PCR和细胞培养及筛选所需要的支持细胞来自其他基因Southernblot技术对筛选出的细胞克隆进行鉴定。敲除小鼠孕12．5d原代培养的胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblas

4、t，MEF)。结果酶切结果表明基因敲除载体pCRCYP3all—KODNA序列正确；转染后的El4胚胎干细胞经过G418筛1．1．2工具酶、试剂盒及其他试剂所有引物均选后，存活的细胞可形成单克隆集落，经过PCR和为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、TaqSouthemblot技术鉴定，其中有5个单克隆被证实CYP3al1酶和PfuU1traTM酶分别购自美国Promega、NEB、基因已被敲除。Stratagene公司；pfuT／A克隆试剂盒为上

5、海生物工结论成功构建了小鼠CYP3al1基因敲除载体，并在小鼠程公司产品；QIAEXII凝胶回收试剂盒为德国El4胚胎干细胞的CYP3ai1基因敲除中获得阳性克隆。QIAGEN公司产品；Ganc和G418sulfate购白美【关键词】胚胎干细胞；细胞色素P450CYP3A；小国Gibco公司；o~_32p．dCTP为美国Amersham公鼠，基因敲除司产品；标记探针用缺口平移试剂盒是华美生物工www．cmbpmet．cn中国医药生物技术20105(4)：272，276程公司产品；1kbladderD

6、NAplus核酸分子量标记购于美国Invitrogen公司；Defined胎牛血清购自细胞色素酶P4503a(CYP3a)负责许多内源美国Hyclone公司；重组小鼠白血病抑制因子性和异生化合物的氧化代谢，是人体肝脏和小肠最(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)购自美国丰富的CYPs，参与毒素、致癌物质、胆汁酸、类Millipore公司；牛蛋白胨、琼脂糖试剂分别购自美固醇激素以及超过50％临床用药等的初级代谢。国Sigma和Biorad公司；其他化学试剂均为分CYP3a11是小

7、鼠肝内微粒体中优势表达的CYP3a析纯。基因【”，在功能上与人类的3a4相类似，但CYP3a的药物代谢谱存在着明显的种系差异J，这给动物作者单位：510182广州医学院医学遗传学与细胞生物学教研室(曾军)；药物实验的有效性带来挑战。利用基因敲除技术构510080广州，中山大学临床药理研究所(王雪丁、黄民)；510006广建药物代谢酶基因缺陷型小鼠和人源化小鼠，可为州，广东药学院微生物学与免疫学教研室(陈宏远)；510275广州，中山大学药学院微生物与生化制药研究室(杜军)深入研究药物代谢酶的功能、药

8、效学和药物致癌等通讯作者：杜军，Emaihdujun@mail．sysu．edu．cn；黄民，Emaihhuangmin提供有效模型『3】。基于此，我们设计并构建了小鼠@mail．sysu．edu．cn药物代谢酶CYP3al1基因敲除载体，并对小鼠收稿日期：2010．02．02中国医药生物技术2010年8月第5卷第4期ChinMedBiotechnol，August2010，Vo1．5，No．42731．2方法1．2．1载体构建方法取培养的El4ES细胞株，裂解并提取