修饰剂对青霉菌葡萄糖氧化酶的效应研究

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1、第49卷第5期厦门大学学报(自然科学版)Vo1．49No．52010年9月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)Sep．2010修饰剂对青霉菌葡萄糖氧化酶的效应研究张茜，闫冰，王勤，刘长勤。，石艳，陈清西¨(1．厦门大学生命科学学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建厦门361005；2．厦门大学附属第一医院，福建厦门361004)摘要：研究了几种修饰剂对青霉菌(Penicilliumamagasakiense)葡萄糖氧化酶(GOD，EC1．1．3．4

2、)活力的影响．结果表明，溴代乙酸、N一溴代丁二酰亚胺(NBS)、乙酰丙酮等对酶的抑制作用较强，随着抑制剂浓度增大，酶活力呈指数下降，酶活力下降5O％的抑制浓度分别为4O．8，28．5和8．7mmol／L，认为咪唑基、吲哚基、精氨酸胍基是该酶的活性功能基团，而蛋白质分子中巯基、二硫键、赖氨酸的c-氨基、丝氨酸残基与酶活力无关．进一步研究了NBS的抑制动力学，结果显示：NBS对酶的抑制作用为非竞争性可逆抑制，抑制常数(Kj)为19．2／~mol／L．该研究对青霉菌GOD在生产上的应用具有一定的理论指导意

3、义．关键词：葡萄糖氧化酶；青霉菌；修饰剂；抑制中图分类号：TQ925．4文献标识码：A文章编号：04380479(2010)05—0707—04葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOD)系统名为：酐、乙酰丙酮、苯甲基磺酰氟(PMSF)对本实验提取纯D一葡萄糖氧化还原酶(EC1．1．3．4)．它能够在有氧化的尼崎青霉菌GOD进行特异性修饰，检测其对该气的条件下专一性催化D一葡萄糖生成葡萄糖酸和酶活性的影响，以此判断不同氨基酸残基与酶活性中过氧化氢[1]．它广泛地分布于动物、植物和微生物体心的

4、关系，为该酶的应用开发提供理论基础．内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为GOD的主要来源，工业上主要利用黑曲霉1材料与方法和青霉菌(Penicilliumamagasakiense)株进行发酵生产．GOD由于其天然无毒、无副作用，自2O世纪被发1．1实验材料现以来，已广泛应用于食品医药、临床化学、分析化学青霉菌(ATCC28686)购自中国工业微生物菌种等许多领域，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用]．保藏管理中心；GOD是由本实验室从青霉菌种制备而在文献E5-1获得尼崎青霉菌GO

5、D电泳单一纯的获得的电泳纯酶制剂；葡萄糖为上海生化试剂厂产品；基础上，本文采用特定的化学修饰剂对青霉菌GOD辣根过氧化物酶为厦门普京生物技术有限公司产品；进行化学修饰作用的研究．化学修饰剂在基础酶学研4一氨基安替吡啉为BioBasicInc产品；其余化学试剂究上常用于以下几个方面：1)探测酶活性必需氨基酸均为国产分析纯；其他生化试剂均为国药集团化学试的性质和数目；2)用于酶纯度的分析与检测；3)用于酶剂有限公司产品．蛋白一级结构的测定；4)探测酶蛋白的结构变化与运动；5)探测酶蛋白的结构变化与运动；

6、6)测定酶蛋白部1．2实验方法分区域的构象状态；7)探索酶的作用机理与催化反应1．2．1蛋白浓度的测定历程；8)探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状蛋白浓度测定采用Folin一酚法．态．近年来，酶分子的化学修饰研究在修饰方法、修饰1．2．2酶活力的测定试剂(反应)及修饰酶的性质等方面，都有很大进展，取得丰硕成果．本文选用巯基乙醇、溴代乙酸、对一氯汞基GOD活力的测定参考文献[5—6]方法．酶活力单苯甲酸盐(pCMB)、N一溴代丁二酰亚胺(NBS)、醋酸位的定义为：在上述条件下，每毫升每分钟催化葡萄

7、糖水解产生1／_tmol产物的酶量．比活力的定义为：每毫收稿日期：2010—01—12克酶蛋白所具有的酶活力单位数．基金项目：国家科技支撑计划项目(2007BA107A24)；厦门市科技1．2．3修饰剂对酶活力作用的测定创新项目(3502Z20081143)*通讯作者：chenqx@xmt1．edu．cn参考文献[7]，将一定量的酶与不同浓度的修饰剂厦门大学学报(自然科学版)2O1O年在室温条件下对酶进行化学修饰作用30rain，然后取针对表1的结果，我们对NBS、溴代乙酸、乙酰丙酮等出100L修饰

8、后的酶液，按1．2．2的方法，在正常的3种修饰剂进行了更深入的研究．酶活力测定体系中检测酶的剩余活力．以酶的相对活2．2修饰剂对酶活力的浓度效应力对修饰剂浓度作图，判断酶活性中心功能基团性质．以NBS、溴代乙酸、乙酰丙酮为效应物，研究它以不加效应物在相同活力测定体系中测定的活力为对们对酶活力影响的浓度效应，结果(图1)表明：随着照组．一种修饰剂均设计3组平行实验．效应物浓度的提高，酶活力逐渐下降，呈现浓度效应．1．2．4修饰剂对酶活力的抑制动力学测定NBS导致酶活力下