淡水鱼类细胞培养方法

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1、《淡水渔业》1991年第2期淡水鱼类细胞培养方法左文功(中国水产科学研宅院长江水产研宅所)鱼类细胞培养研究大约已有三十年历氏滤器、混合纤维素酯微孔滤膜(0．3或0．45史。自Clem等(1961)建立的GF一1细胞株微米)、量筒(1000毫升)、三角瓶(1000毫同世以来的有关统计，到1979年为止国外相升)、链霉索瓶、血清瓶(1O0、250、500毫继报告来自冷水性和温水性真骨鱼类组织的升)、碾子和手术剪、酒精灯、脱指棉和脱脂细胞系已有61种，现在业已大大地超过了该纱布等。数字我国鱼类细胞培养研究开始于70年二、细胞培养液和

2、各种溶液的配制代，1981年张念慈和杨广智报告了草鱼吻端组织二倍体细胞株zc一7001及其亚株zc一(-)细胞培养液的配制：细胞培养的液7901S-的建立，同年台湾省陈秀男和郭光雄体可分为生长液及维持液。生长液是用于培亦报告建立了鳗鱼卵巢组织细胞系，陈秀男养单细胞或组织块使细胞分裂而生长成单层等(1982、1983)还先后报告建立了鳗鱼肾细胞生长液含有为繁殖细胞所需要的全部脏组织和罗非鱼卵巢组织的细胞系，左文功代谢营养物，一般含有较多的血清(10～等(1986)报告了草鱼肾脏组织细胞系CII~_的20)维持液是用于维持已成单层

3、的细胞，建立，李焕林等(1988)报告了草鱼吻端成以便可随时用来繁殖病毒和滴定病毒，以及纤维细胞系PSF的建立。现在，鱼类细胞培运输单层细胞时用，它与生长液的不同处仅养技术在我国已具备扎实的基础，达到了较是小牛血清的含量低些，一般只有2～5。高的水平本文结合笔者多年工作的经验，全常用的鱼类细胞培养液有EagleMEM和面系统地介绍淡水鱼类细胞培养的准备工作109、16d0等培养液。日本日水制药株式会社和原代培养、传代培养以及细胞保存等方法。生产的EaglcMEM又有很多型号，找们常用的是EagleMEMNissui①，现将配制

4、方法介一、细胞培养的设备和器械绍如下：称取9．4克EagleMEM溶于1000毫细胞培养实验室应有以下设备：无菌室升双蒸水中，l5磅高压蒸气灭菌15分钟，冷和超净工作台、倒置显钕镜、恒温培养箱、电却后，在无菌室内加过滤灭菌的谷氪酰胺热干燥器、低温冰箱、普通冰箱、电热手提(Glutamine)0．3克，再用大约l0毫升的高压蒸气消毒器、恒温水浴槽、离心机(d0007．5的碳酸氢钠调pH至7．2～7．d，然后分转／分)、真空泵等。装备用，生长液用前再加l0～20小牛血实验室还需准备下列器械和材料：细胞清，维持液用前再加2～5小牛血

5、清。培养瓶(25和1O0毫升)、白色橡皮塞、注射(-)7．5碳酸氢钠的配制器和兽用封闭针、移液管(1或2毫升)、蔡称取碳酸氢钠7．5克溶于l00毫升双蒸38水中，过滤除菌或在密封状态下高压蒸气灭三、玻璃器皿和器械的清洗和消毒菌，然后小瓶分装，4℃冰箱保存备用(三)Hanks液的配制在细胞培养工作中必须使用十分洁净的1．NaC1：8克KC1{0．4克MgSO4·无菌的玻璃器皿和器械，各种器械在使用之71-12O：0．1克MgClz·6H~,O{0．1克前必须进行清洗和消毒。将上述试剂溶于800毫升双蒸水中。新的玻璃器皿，特别是培

6、养瓶等，用自2．CaCI2(无水)：0．14克来水洗去表面灰尘后，在2盐酸溶液中浸将其溶于100毫升双蒸水中。泡过夜，以除去玻璃表面的游离碱．再用自3．葡萄糖：1．0克Na2HPO_·12H2O：来水冲洗干净，凉干后用清洁液浸泡去污，然0．152克KH2PO_0．06克0．4酚红液：后再用自来水多次冲洗，还必须用单蒸水和5毫升双蒸水分别淋洗三次以上，方可使用使用将上述试剂溶于100毫升双蒸水中。过的玻璃器皿，从清洁液浸泡去污开始亦应然后再将以上三种溶液混和．8磅25～如此处理。30分钟灭菌，或过滤除菌，保存在5℃备用，胶塞用白

7、色橡胶塞较好，园红色和黑色用前以7．5碳酸氢钠调pa的胶塞毒性更大，新胶塞需用2NaOH煮沸(四)0．4酚红液的配制3～5分钟，再用4HCI煮沸3～4分钟，以称取0．4克酚红置于干净的玛瑙研钵除去毒性，然后再用自来水冲洗，单蒸水和中，逐渐加入0．1N氢氧化钠，并不断研磨，双蒸水淋洗直到颗粒完全溶解，所加的NaOH应为清洁液根据不同的强度有不同的配方，l1．28毫升，将已溶解的溶液吸入100毫升我们常用的配方是；重铬酸钾100克，溶解量瓶中．最后加双蒸水到100毫升，摇匀后于100毫升水中，再缓缓加入浓硫酸1000毫于5℃保存。

8、升，并不断搅拌为了安全．应使用不锈钢Cf)0．25胰蛋白酶溶液的配制桶配制称取胰酶(1：250)0．25克，溶于100消毒方法因材料而异，我们实验室的玻毫升Hanks液中，于37'(2水溶中放置30分璃器皿和解剖器械是包扎好后采用180'(2干钟，不得超过37℃，待完全溶解．