致病性大肠杆菌胃肠感染小鼠模型血浆Th1、Th2、Th17淋巴细胞因子变化和意义.doc

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1、致病性大肠杆菌胃肠感染小鼠模型血浆Thl.Th2.Thl7淋巴细胞因子变化和意义［摘要］目的检测小鼠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli,EPEC)腹泻模型的外周血血浆中的辅助性T淋巴细胞1、2、17型(Thl、Th2、Thl7淋巴细胞)代表因子，探索小鼠胃肠道感染时免疫反应的变化。方法普通健康昆明小鼠40只随机分成生理盐水对照组(20只)和实验组(20只)。实验组EPEC灌胃，建立小鼠感染性腹泻动物模型。对照组生理盐水灌胃。细菌灌胃后24h取实验组和对照组外周血，离心后取血浆。采用流式液相多重蛋白定量技术(CBA技术)检测血浆

2、中的白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、伽马干扰素(IFN-Y)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10).白介素4(IL—4)、白介素17A(IL-17A)淋巴细胞因子水平。结果实验组小鼠灌胃前白细胞(WBC)［7.10(5.825,8.625)X109］较灌胃后WBC［28.85(18.80,38.35)X109］差异有统计学意义(P0.05)o结论EPEC感染小鼠后IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IL-17A淋巴细胞因子水平改变，Thl/Th2/Thl7细胞参与此免疫反应，小鼠体内以Th2细胞介导的体液免疫为主，Thl细

3、胞介导的免疫反应在小鼠模型的炎性反应过程中占非主导地位。［关键词］动物模型；腹泻；细菌感染；淋巴细胞因子［中图分类号］R574.62［文献标识码］A［文章编号］1673-7210（2013）07（a）-0037-03感染性疾病在儿童疾病谱中仍占首要位置，在胃肠道感染疾病中，EPEC在发展中国家儿童中的发病率较高［1-2］,尤其是3岁以下的幼儿，且疾病的危害性大。在儿童胃肠感染性疾病中，近年来有关轮状病毒性腹泻疾病中CD4+T淋巴细胞亚群及其代表因子的研究较多，细菌性腹泻病例散发、不易收集，国内外文献关于细菌性腹泻病例的CD4+T淋巴细胞亚群代表因子研究

4、少有报道。Thl、Th2、Thl7淋巴细胞是CD4+T淋巴细胞的三个亚群，在感染性疾病和免疫相关等疾病中发挥着重要作用。本研究以小鼠细菌感染性腹泻为疾病模型，探索小鼠经口感染EPEC后外周血浆中的Thl、Th2、Thl7淋巴细胞代表因子水平的变化以了解小鼠的免疫反应特点。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物普通健康昆明小鼠40只，雌雄各半，体重18〜22g（5〜6周龄，购自军事医学科学院实验动物中心，检验检疫合格），于军事医学科学院实验动物中心屏障实验室进行实验。将40只昆明小鼠随机分成生理盐水对照组（20只）和实验组（20只）。1.1.2主要实验

5、试剂与仪器致病性大肠杆菌（EPEC-E2348/69）（军事医学科学院实验动物中心惠赠）,小鼠T淋巴细胞因子CBA组合试剂盒（BD美国），血细胞分析仪（NIHONKOHDEN日本），离心机（德国KENDRO公司），-8CTC冰箱，涡旋混匀器（IKA公司），流式细胞仪（美国BD公司）。1.2感染性腹泻小鼠模型制备1.2.1实验组所有小鼠均单笼饲养，实验前禁食24h、禁水1ho①实验开始前对每只小鼠进行眼眶静脉采血，放置于经EDTA钾盐溶液浸润过的容器中，留作血细胞分析。②给每只小鼠灌胃3%碳酸氢钠溶液0.3mLo③配制浓度为5X108cfu/mL的致病性

6、大肠杆菌混悬液，灌胃碳酸氢钠溶液半小时后，对实验组每只小鼠灌入细菌混悬液0.5mL；4.8h后更换空鼠笼，不添加垫料，观察小鼠的大便性状。1.2.2对照组对照组不作血常规检测，处理因素将致病性大肠杆菌混悬液更换为生理盐水0.5mL,余处理过程同实验组。1.2.3实验中观察及检测指标①灌胃8h后，观察小鼠的大便性状、精神状态、行动动作。②灌胃后第24小时,对实验组所有小鼠采血进行血细胞分析。小鼠精神萎靡、少动或激惹躁动，大便性状为黏液、稀便，血细胞分析白细胞计数结果差异有统计意义则视为造模成功。1.3感染性腹泻小鼠外周血T淋巴细胞因子检测1.3.1外周血

7、采集及血浆分离在第24小时对实验组、对照组小鼠行摘眼球法取血，取部分血行血细胞分析，余下经过离心10min（3000r/min,离心半径16.5cm）,收集血浆，冻存于-8（rc冰箱中以备统一检测。1.3.2T淋巴细胞因子检测上述血浆在TTC孵化箱中解冻，细胞因子检测具体步骤按试剂盒说明书进行，经过流式细胞仪上机处理后可获得各细胞因子的荧光强度值，通过标准曲线换算成相应浓度（自动换算），结果以ng/L表示。1.4统计学方法采用SPSS18.0软件进行统计学分析，非正态分布及未知分布形态总体采用秩和检验WilcoxonW检验，数据以M（P25,P75）中

8、位数、四分位间距表示。以P0.05,P二0.086>0.05)o见表1。2.2血浆中Thl、T