平板对峙实验.doc

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1、2.1.2.3拮抗菌的初蹄(异步抬抗实验)以甜瓜枯萎病菌为指示菌,将分离到的放线菌、细菌以及真菌菌株点接至已经在PDA培养基培养3d的病原菌平板四周,点接处距离病原菌中心2cm,同12甜瓜枯萎病病原拮抗菌的蹄选及利用响应面法优化发酵条件一平板上只点接一种分离菌;继续培养4d,观察是否出现抑菌带,将出现抑菌带的分离菌作为初蹄菌。2.1.2.4拮抗菌的复蹄平板对峙实验(同步措抗实验)以甜瓜枯萎病菌为指示菌,将初蹄得到产生抑菌带的菌株,用打孔器打取5mm(<2)菌饼接种于距离病原菌中心2cm的四周,同一平板上只接一种初蹄菌;培养4d后测抑菌圈半径[79]、拮抗菌半径,计算拮

2、抗指数[8^。抑菌圈半径=拮抗菌菌饼中心至甜瓜枯萎病病菌菌丝边缘的距离措抗指数=(抑菌圈半径-拮抗菌半径)/措抗菌半径继代培养实验将蹄选的拮抗效果较好的菌种进行继代培养,逐代进行平板对峙实验,观测其措抗指数的变化,从而确定菌种的遗传稳定性。发芽率实验将蹄选的措抗效果较好的菌株转接至PDB培养基中摇床振荡培养24h,即得措抗菌菌悬液;挑取饱满的南海蜜甜瓜种子,用10%H202对种子进行表面消毒5min后用无菌水清洗3-4次,再将种子浸泡于拮抗菌菌悬液中2h,同时以未加入措抗菌的PDB做对照,每处理30粒甜瓜种子,三次重复;浸泡完毕后,将甜瓜种子置于灭菌培养皿中的湿润无菌

3、滤纸上,种子上加盖一层湿纱布,30°C催芽36h,统计种子的发芽率。拮抗菌间平板对時实验同“平板对峙实验(同步拮抗实验)”。苦瓜活性物质提取分离与抑菌作用研究1.2.2中草药提取液对病原真菌抑制作用的测定(生长速率法[8-9])参照吴新安[10]等人的方法,分别制成含药10.0mg/mL的带药培养基,用直径5mm的打孔器在培养好的菌落外缘切下带菌培养基柱,即菌饼,将菌饼带菌丝的一面接种到培养皿中央。以纯PDA培养基平板作空白对照(CK),含化学药剂扑海因0.5mg/mL的培养基平板作负对照(CK-),将各处理置于28℃恒温箱中培养。每个处理设3次重复。定期观察菌落形态

4、并用十字交叉法测量菌落直径,直到CK菌落即将长满平皿为止,计算抑制生长率。抑制生长率(%)=(CK净生长量-处理净生长量)/CK净生长量×100[11]。