spectrum living image 40软件操作流程

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1、SpectrumLivingImage4.0软件操作流程本流程主要介绍Spectrum的LivingImage4.0软件的应用，包括参数介绍、生物发光、荧光二维及三维成像的图像获取及数据分析1、控制面板参数介绍关键参数，决定灵敏度整个图像的获取过程都通过该控制面板操作，其中曝光时间、bin值及光圈大小是最为关键的参数，直接影响图像获取的质量。曝光时间（exposuretime）曝光时间决定了信号强度，曝光时间越长，信号强度越高，实验时应根据实际情况设定适当的曝光时间，初次实验若不知道合适曝光时间，可选择Auto曝光，仪器会自动检测一个合适的曝光时间以成像，当信号较弱时可适当增加曝光时间以

2、获取较佳信号。注：生物发光成像的曝光时间为分钟（min）级别，而荧光成像的曝光时间为秒（sec）级别，实验时应注意参数设定。Bin值（Binning）Bin值表述的是将多少像素作为感光单元，bin值越大则表示应用更多的像素作为一个感光单元，因此，bin值越大则灵敏度越高，而分辨率会有所牺牲，当信号强度较弱时可适当增加bin值以获取信号。LargeBinning(16)MediumBinning(8)SmallBinning(4)光圈大小（f/stop）光圈大小决定了光的透过量，光圈越大，穿过光圈到达CCD的光越多，面板中的数字为F/stop中的分母数字，因此，数字越小代表光圈孔径越大，透

3、过的光越多，当信号较弱时可通过增大光圈（减小数字）而增强信号探测能力。f/1f/8视野范围（FiledofView）视野范围用于调节观测的视野大小，共有A/B/C/D四档可选，分别代表不同大小的视野范围，实验时根据一次观察小鼠个数选择合适的视野范围进行成像。FOVA:4.0cmFOVB:6.5cmFOVC:12.5cmFOVD:21.5cm成像聚焦（Focus）成像的聚焦包含自动聚焦和手动聚焦功能，在用小鼠进行成像时，一般默认成像对象的高度为1.5cm，仪器会自动完成聚焦，在用其他对象进行成像时（如大鼠），可调节Subjectheight参数，设定合适的聚焦高度，也可在Focus下拉选项

4、中选择聚焦设定2、生物发光二维成像的图像获取勾选Luminescent、Photograph及overlay选项，设置好曝光时间（生物发光曝光时间为分钟级别）、bin值、光圈大小及视野范围等参数（软件有默认参数，可按照默认参数成像，若效果不佳，则再调整各参数，调整的次序按照曝光时间＞bin值＞光圈大小顺序调整），EmissionFilter选项设置为open，Photograph选项的参数一般情况无需调整，所有参数设定完毕后点击Acquire按钮即可开始成像。成像完成后，在得到结果图的同时会弹出实验信息记录对话框（下图右框），可输入相关实验信息以记录实验情况，一次可最多同时选择5个选项进

5、行记录，记录完成后，记录的相关信息会反映在结果图中，点击结果图中的info按钮即可看见。3、荧光二维成像的图像获取荧光二维成像与生物发光二维成像的操作流程基本类似，只是多了一些参数的设定，另外，对于需要扣除背景的成像，需应用到荧光光谱分离技术，该技术的操作流程将在第4节中详细说明，本节主要介绍获取单张荧光二维图片的操作流程。荧光二维成像可选择使用反射照明或透射照明进行荧光激发，当信号在皮下等较浅部位时可选择反射照明成像，而当信号位于肝脏等较深部位时可选择透射照明（Transillumination）进行成像。对于反射照明成像具体步骤如下：勾选Fluorescent、Photograph及

6、overlay选项，设置好曝光时间（荧光曝光时间为秒级别）、bin值、光圈大小及视野范围等参数（软件有默认参数，可按照默认参数成像，若效果不佳，则再调整各参数，调整的次序按照曝光时间＞bin值＞光圈大小顺序调整），根据标记所用探针的激发光及发射光波长，选择合适的激发光（Excitation）及发射光（Emission）滤片，Photograph选项的参数一般情况无需调整，所有参数设定完毕后点击Acquire按钮即可开始成像。选择荧光成像模式透射照明选择滤光片对于透射照明成像，其他步骤与反射照明成像相同，只是需要选择Transillumination选项，点击Setup按钮进行透射点的选择

7、，对于单张图片的获取只需选择一个点。绿色代表点已选上4、荧光光谱分离SpectralUnmixing是一种将背景荧光信号与荧光探针信号分离的光谱分离方法。其应用主要包括两方面：1、将特异性荧光信号从组织自发荧光中分离出来；2、将不同的探针信号分开，用于多种探针同时成像。这里以反射荧光成像为例，详细介绍应用LivingImage4.0进行SpectralUnmixing的具体步骤。更详细的说明请参见UserGuide。点击Sequen