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1、选修1《生物技术实践》知识点归纳实验1 大肠杆菌的培养和分离1.微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核,只有一环状DMA分子(拟核)。以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜)、兼性厌氧的肠道杆菌。2.细菌的分离方法有两种:划线分离法和涂布分离法。是消除污染
2、杂菌的通用方法,也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线的过程中菌液逐渐减少,细菌也逐渐减少,。划线最后,可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养10~20小时后,一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞,形成菌落,不会重叠。在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是有一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌,可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因),如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素,由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因,所以在划线后只有存在抗性基因
3、的工程菌能生存下来。涂布分离时,需要先将培养的菌液稀释,通常稀释10-5~10-7倍之间,然后取0.1mL不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落，每个培养基里有20个以内的单菌落为最合适。优点：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。 在培养微生物时,必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的,各种培养基也必须是无菌的,转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌(防止杂菌污染)。进行恒温培养时,要将培养皿倒置,是因为培养基中的水分会以
4、水蒸气的形式蒸发,倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后,落入培养基的表面并且扩散,菌落中的细菌也会随水扩散,菌落相互影响,很难再分成单菌落,达不到分离的目的。 4.细菌扩大培养要用LB液体培养基(通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业),划线分离要用LB固体培养基(常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存)。我们在利用微生物时,常常要求所利用的微生物不被其他微生物污染。因此,在培养微生物时必须进行无菌操作 无菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的,如各种大小的培养皿、试管、三角瓶、取样器的头(或称“枪头”、“tip”)、移液管、三角刮刀、接种环、镊子等等。这些用具通常用高
5、压蒸汽灭菌法前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好。培养皿可几个包在一起;试管加棉花塞或塑料盖后也是几个包在一起;三角瓶可用封口膜(市售产品,既通气又不使菌进入)或6层纱布封口,再用牛皮纸或报纸封口;移液管上端用镊子放入少量棉花,再用牛皮纸包上(现在多不用移液管而用取样器);取样器的“枪头”放在可灭菌的专用塑料盒中,也可放在上口用牛皮纸包好的烧杯中……在121℃(1kg/cm2压力)下灭菌15min。值得注意的是,实验中所需的棉花不能用脱脂棉,因脱脂棉易吸水,吸水后容易引起污染。灭菌后,通常将实验用具放入60~80℃的烘箱中烘干,以除去灭菌时的水分。在进行实验操作前,将需要使用的用具从
6、烘箱中取出,放到超净台上(没有超净台时,可制作一个双手在内操作、又可在外观看、并有紫外灯灭菌的箱子),然后打开紫外灯和过滤风,灭菌30min。 除了实验用具必须无菌外,各种培养基也必须是无菌的。培养基是微生物生存的环境和营养物质。“细菌喜荤,霉菌喜素”,通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制,还要加入一定量的氯化钠,以维持一定的渗透压;霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。此外,细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长,霉菌要求在中性偏酸的环境中生长,因此,在制备培养基时需调节培养基的酸碱度。加入培养基的三角瓶、试管也要在121℃下灭菌15min,如果培养基中有葡萄糖
7、,为防止葡萄糖分解碳化,要用500g/cm2压力(90℃以上)灭菌30min。有些不能加热灭菌的化合物,如尿素(加热会分解等,只能用G6玻璃砂漏斗过滤,但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。玻璃砂漏斗有6种,即G1~G6,G6孔径最小,细菌不能滤过。玻璃砂漏斗用后需用1molL的HCL浸泡,并抽滤去酸再用蒸馏水洗至洗出液呈中性,干燥后保存。 在将培养基加到三角瓶、试管和培养皿中时,三角瓶口、试管口、培养皿壁上不能沾有培养基,否则容易发生污染。因此,在将培养基转移到
