肠道细菌对阿魏酸的代谢研究

《肠道细菌对阿魏酸的代谢研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第42卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2014年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry244～248DOI：10．3724／SP．J．1096．2014．30648肠道细菌对阿魏酸的代谢研究张蔚江曙钱大玮尚尔鑫管汉亮任浩段金廒(南京中医药大学，江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，南京210046)摘要研究人体肠道细菌对阿魏酸的代谢。采集健康志愿者新鲜粪便，称重稀释后厌氧培养，通过反复涂布分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液

2、相四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC—Q—TOF／MS)与Metabolynx软件分析阿魏酸经人体粪便混合菌及分离的单菌作用后的代谢产物，共鉴定出了3种代谢产物，分别是氢化产物、去甲基化产物及去甲氧基化产物；此外，筛选出了对阿魏酸有特殊代谢活性的2种单菌，其中一种为已鉴定了的Bacillussp．46；而另一种未知的细菌则用16S核糖体RNA(16SrRNA)技术进行了鉴定，结果表明，此细菌为Enterococcussp．45。本研究提示肠道细菌对阿魏酸有代谢作用且由不同细菌完成。关键词阿魏酸；肠道细菌；超高效

3、液相四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC—Q—TOF／MS)；代谢产物；16S核糖体RNA(16SrRNA)1引言人肠道中大约有100多种总数超过10的细菌栖息，其中99％为厌氧菌，这些细菌统称为“肠内细菌群”，共同构成了肠道的微生态环境¨I2。肠道菌群能产生多种药物代谢酶，主要包括水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶等』。口服药物进入肠道后，不可避免地在肠道菌群作用下发生代谢转化，产生出具有不同生物活性的代谢产物，因此肠道菌群在人体的药物代谢活动中起着重要作用J。阿魏酸(Ferulicacid)，化学名为4一羟基

4、一3一甲氧基苯丙烯酸，是阿魏、川芎、当归、升麻、木贼等多种中药的有效成分之一。药理实验表明，阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化，抗肿瘤、抗突变、增加免疫力等多种作用．oJ，已成为临床常用的活血祛瘀药物之一。目前，已有大量关于阿魏酸体内代谢研究的报道'，但有关人体肠道混合菌及单种细菌对阿魏酸的生物转化研究却鲜有报道l9J。本研究采集了健康志愿者新鲜粪便，通过反复的涂布和培养，最终分离得到69种人体肠道细菌。采用超高效液相四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC—Q—TOF／MS)与Metabolynx软件¨叫寻找阿

5、魏酸与人体肠道混合菌及单菌培养后的代谢产物，并用16S核糖体RNA技术(16SrRNA)对具有特殊代谢活性的细菌进行了鉴定，鉴定出了对阿魏酸具有代谢活性的细菌，为全面了解肠道细菌对阿魏酸的代谢提供了依据。2实验部分2．1仪器与试剂UPLCAcquityⅢ系统(Waters公司)；SynaptQ—TOF质谱仪(Waters公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；Masslynx4．1质谱工作站软件(Waters公司)；MetaboLynx”分析软件(Waters公司)；MLS一3750型高压蒸汽灭菌器(SANYO公司)

6、；GNP-9080型隔水式恒温培养箱(上海三发科学仪器有限公司)；WD．9402A型PCR扩增仪(北京六一仪器公司)；DYY．8C电泳仪(北京六一仪器公司)；TGL．16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；XW．80A微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；TD2102电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；EPED型超纯水系统(南京易普达易科技发展有限公司)。阿魏酸(中国药品生物制品检定所，批号110773—201012)；Pfu—X7(DNA聚合酶)、Pfubuffer(聚合酶链式反应缓冲液)、dNTPs

7、(4种脱氧核糖核酸)、DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒(上海博亚生物技术有限公司)；乙腈与甲酸为色谱纯，其余试剂为分析纯。20134)6—2O收稿；2013-10一l2接受本文系江苏省高校自然科学基金重大研究项目(No．10KJA360039)和江苏省方剂高技术研究重点实验室建设项目(No．BM2010576)资助E—mail：qiandwnj@126．COII1第2期张蔚等：肠道细菌对阿魏酸的代谢研究准确称取阿魏酸对照品适量，用超纯水超声溶解，配制成2．0g／L标准溶液，4c【=中保存备用。2．2普通厌氧

8、培养液(GAM)的配制、灭菌称取胰蛋白胨10．00g，大豆蛋白胨3．00g，朊胨1O．00g，酵母浸膏5．00g，血清消化粉13．50g，牛肝浸出粉1．20g，牛肉膏2．20g，葡萄糖3．00g，KHPO2．50g，NaC13．00g，可溶性淀粉5．00g，L一半胱氨酸盐0．30g，硫代乙醇酸钠0．30g，用超纯水加热溶解，调节至pH7．2并最终定容至1000mL。准确称